Obtención de una suspensión unicelular a partir de tejido del hipocampo de ratón

Resumen

Fuente: Trujillo, M., et al. Disociación mecánica y enzimática combinada del tejido del hipocampo del cerebro del ratón. J. Vis. Exp. (2021)

Este video muestra un protocolo para obtener una suspensión unicelular altamente viable del hipocampo del cerebro del ratón utilizando una combinación de disociación mecánica automatizada y una mezcla de enzimas para ayudar en la digestión enzimática.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Prepare la mezcla de enzimas 1 y 2 para cada muestra

NOTA: Para volúmenes superiores a 2 mL, utilice una pipeta serológica de 10 mL; para volúmenes, 200 μL-2 mL, utilice una pipeta de 1000 μL; para volúmenes, 21-199 μL, utilice una pipeta de 200 μL; para volúmenes, 2-20 μL, utilice una pipeta de 20 μL; para volúmenes inferiores a 2 μL, utilice una pipeta de 0-2 μL.

1. Para cada muestra, descongele una alícuota de enzima P y una enzima A a temperatura ambiente.
2. Para la mezcla de enzimas 1, combine 50 μL de enzima P y 1900 μl de tampón Z en un tubo C etiquetado (Tabla de materiales).
3. Para la mezcla de enzimas 2, agregue 20 μL de tampón Y a la alícuota descongelada de 10 μL de enzima A.

>2. Protocolo de disociación cerebral en adultos

NOTA: Cuando se trabaja con muestras, los tubos deben colocarse en una gradilla de tubos a temperatura ambiente mientras BSA y D-PBS permanecen en hielo a menos que se indique lo contrario.

1. Encienda el disociador.
2. Use fórceps para transferir los pedazos de tejido del hipocampo al tubo C.
3. Transfiera 30 μL de la mezcla de enzimas 2 al tubo C. Gire la tapa hasta que se sienta tensión, luego apriétela hasta que haga clic.
4. Coloque el tubo C boca abajo en una posición del disociador; a la muestra se le asignará el estado Seleccionado (Figura 1). Asegure el calentador sobre el tubo C.
5. Presione el icono de la carpeta, seleccione la carpeta Favoritos, desplácese y seleccione el programa 37C_ABDK_02. Haga clic en OK para aplicar el programa a todos los tubos C seleccionados, luego toque Start (Figura 1).
6. Etiquete un tubo cónico de 50 mL por muestra.
7. Coloque un filtro de células de 70 μm en cada tubo cónico de 50 mL y humedezca con 2 mL de tampón BSA.
8. Al finalizar el programa, retire el calentador y el tubo C del disociador.
9. Agregue 4 mL de tampón BSA a la muestra y aplique la mezcla al filtro de células en el tubo cónico de 50 mL.
10. Agregue 10 ml de D-PBS al tubo C, ciérrelo y agite la solución suavemente. Aplíquelo en el filtro de células en el tubo cónico de 50 mL.
11. Deseche el filtro de células y el tubo C. Centrifugar la suspensión a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Luego, aspire y deseche el sobrenadante.

>3. Remoción de escombros

1. Vuelva a suspender el pellet con 1550 μL de D-PBS frío y transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 mL marcado.
2. Agregue 450 μL de solución fría de eliminación de residuos y pipetee hacia arriba y hacia abajo (no haga vórtice).
   nota: La solución de eliminación de escombros es un reactivo en el kit comercial de disociación Brian para adultos.
3. Superponga suavemente 1 mL de D-PBS frío sobre la suspensión de la celda, manteniendo la punta contra la pared del tubo cónico. Repita hasta que la superposición total sea de 2 mL.
   nota: Este paso es fundamental; Actuar con destreza y destreza.
4. Centrífuga a 3000 x g durante 10 min a 4 °C con aceleración total y freno completo.
   nota: Si las fases no están claramente separadas, repita los pasos 7.2-7.3. Centrifugar por última vez a 1000 x g durante 10 min a 4°C.
5. La suspensión ahora debería constar de tres capas distintas (Figura 2). Aspira la capa superior. Pase la punta de la pipeta hacia adelante y hacia atrás para aspirar la capa intermedia blanca. Retire la mayor cantidad posible de la capa intermedia sin alterar la capa inferior.
   nota: Este paso es fundamental; Actuar con destreza y destreza.
6. Agregue 2 mL de D-PBS frío y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
7. Centrífuga a 1000 x g durante 10 min a 4 °C con aceleración total y freno completo. Aspirar y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de tampón BSA.
   NOTA: Las células se pueden resuspender en el tampón apropiado y luego marcarse y aislar magnéticamente en preparación para la secuenciación de una sola célula en este punto.

Resultados

Figura 1: Estado seleccionado en el paso 2.4

Figura 2: Suspensión de tres capas en el paso 3.5: Tampón (capa superior), restos de celdas, solución de eliminación de residuos y celdas (capa inferior).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Fisher Científico	02-682-003	Basix, color surtido
Tubos Falcon de 15 mL	Becton Dickinson Labware Europa	352009	poliestireno
25 mL Pipetas serológicas	Fisher Científico	14-955-235
Filtro de células de 70 μm	Fisher Científico	08-771-2
Kit de disociación cerebral para adultos	Miltenyi Biotec	130-107-677	Contiene enzima P, tampón Z, tampón Y, enzima A, tampón A, solución de eliminación de residuos
Bsa	Sigma-Aldrich	A7906-50G
Tubos de centrífuga cónicos Falcon de 50 mL	Fisher Científico	Teléfono 14-432-22
gentleMACS Tubos C	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo Disociador con Calentadores	Miltenyi Biotec	130-096-427
Gibco DPBS (1X)	ThermoFisher Scientific	14190144
Vaso de precipitados de vidrio	Fisher Científico	02-555-25A
Puntas de pipeta GP LTS 20 μL 960A/10	Lluvia	30389270
Puntas de pipeta GP LTS 250 μL 960A/10	Lluvia	30389277
Puntas de pipeta RT LTS 1000 μL FL 768A/8	Lluvia	30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL)	Lluvia	30386597
Cubitera redonda con tapa	Fisher Científico	07-210-129
Tubos de fondo redondo con tapa de filtro de celdas	halcón	100-0087