Preparación de una suspensión unicelular de células inmunitarias a partir de tejido cerebral murino

Resumen

Fuente: DiSano, K. D., et al. Aislando los tejidos del sistema nervioso central y las meninges asociadas para el análisis posterior de las células inmunitarias. J. Vis. Exp. (2020).

El video muestra la preparación de una suspensión unicelular de células inmunitarias a partir de un tejido cerebral murino. Implica la digestión enzimática para liberar células del tejido cerebral, seguida de la centrifugación en gradiente de densidad para aislar las células inmunitarias en función de sus densidades para obtener la suspensión unicelular.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Preparación de suspensiones unicelulares de tejido cerebral y de médula espinal

1. Transfiera el tejido del cerebro o la médula espinal con medios a la parte superior de la placa de Petri de 100 mm vertiendo el tejido y los medios del tubo. Con pinzas, mueva el tejido al fondo de la placa de Petri. Pica finamente el cerebro o la médula espinal con una cuchilla de afeitar estéril. Con la cuchilla de afeitar, mueva el pañuelo picado al fondo del plato raspando para recoger el pañuelo.
   nota: Para el protocolo de digestión enzimática a continuación, se pueden agrupar hasta dos médulas espinales para su procesamiento. Los cerebros deben ser procesados individualmente.
2. Con una pipeta serológica de 5 mL, agregue 3 mL de medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute (suplementado con suero fetal de ternero (FCS) al 10% a la placa de Petri. Con una pipeta serológica de 10 mL, pipetee hacia arriba y hacia abajo para resuspender el tejido en el medio y transferirlo a un tubo cónico de 15 mL.
   nota: Si la aplicación posterior es el análisis de secuenciación de ARN a granel o de una sola célula o el cultivo celular, los lotes de FCS deben probarse para garantizar que las células no se activen antes del análisis. Alternativamente, las celdas se pueden procesar usando 1x PBS con 0.04% BSA en lugar de RPMI con 10% FCS.
3. Con una pipeta serológica de 10 mL, lave la placa de Petri con 2 mL adicionales de medio para recoger cualquier tejido residual y transfiéralo a un tubo cónico para obtener un volumen total de 5 mL. Mantenga los tubos en hielo entre los pasos de procesamiento.
4. Con una pipeta, vuelva a suspender el polvo de colagenasa I en un medio de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) para obtener la concentración deseada (es decir, 100 mg/ml). Añadir colagenasa tipo I al tubo cónico que contiene la muestra de tejido picado para obtener la concentración final deseada (es decir, 50 μL para 1 mg/mL)
   nota: Las concentraciones más altas de colagenasa aumentarán el rendimiento celular, pero pueden escindir los marcadores de la superficie celular. Por lo tanto, los lotes de colagenasa I deben valorarse para determinar la concentración óptima necesaria para obtener el mayor número de células viables con todos los marcadores de superficie celular necesarios intactos. Por ejemplo, la colagenasa I se analizó a concentraciones finales de 0,5 mg/mL, 1 mg/mL y 2 mg/mL en muestras individuales de cerebro o médula espinal. La viabilidad celular se determinó mediante el método de exclusión de azul de tripano y los marcadores de superficie celular CD45, CD19 y CD4 se evaluaron mediante citometría de flujo. Una concentración de 1 mg/mL de colagenasa I produjo el recuento más alto de células vivas mientras conservaba todos los marcadores de superficie celular de interés. Por lo tanto, esta concentración se utilizó para experimentos posteriores que examinaron estos tipos de células.
5. Vuelva a suspender suavemente el polvo de DNasa I con cloruro de sodio 0,15 M hasta la concentración de caldo deseada. Añadir la DNasa I resuspendida al tubo cónico que contiene la muestra de tejido picado para obtener una concentración final de 20 U/mL.
   nota: Los lotes de DNasa I varían según las unidades de actividad por mL. La concentración que se añadirá a la muestra de tejido cambiará en función de las unidades de actividad por mililitro del vial de stock. La concentración final deseada por muestra es de 20 U/mL.
6. Coloque los tubos en una rejilla de tubos en un baño de agua a 37 °C e incube durante 40 min. Invierta los tubos cada 15 min para mezclar bien el tejido con las enzimas. Después de la incubación, añadir 500 μL de EDTA 0,1 M (pH = 7,2) a cada tubo para obtener una concentración final de 0,01 M de EDTA e incubar durante 5 min más para inactivar la colagenasa.
7. Con una pipeta serológica de 10 mL, agregue 9 mL de RPMI suplementado con FCS al 10% a cada tubo para llevar el volumen de cada tubo a ~14,5 mL. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Con una pipeta Pasteur al vacío, aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no tocar el pellet de la célula.
8. Con una pipeta serológica de 5 mL, agregue 3 mL de solución de gradiente de densidad isotónica al 100% de stock al tubo que contiene el gránulo de celda. Con una pipeta serológica de 10 mL, agregue medios RPMI 10% FCS adicionales para llevar el volumen final a 10 mL y vuelva a suspender el pellet celular para crear una capa de solución de gradiente de densidad isotónica del 30%
   nota: Prepare el medio de gradiente de densidad isotónica 100% de stock con anticipación, alícuota, y almacene a 4 °C durante un máximo de 3 meses. Para preparar la solución de gradiente de densidad isotónica al 100%, diluya el medio de gradiente de densidad (Tabla de materiales) con tampón de dilución de medios de gradiente de densidad. Prepare el tampón de dilución de medios de gradiente de densidad (80,0 g/L de NaCl, 3,0 g/L de KCl; 0,73 g/L de Na₂HPO₄, 0,20 g/L de KH₂PO₄; 20,0 g/L de glucosa) y filtre la esterilización mediante un sistema de filtro de vacío. Prepare la solución de gradiente de densidad isotónica al 100% mezclando 1 parte del tampón de dilución de gradiente de densidad y 9 partes de medios de gradiente de densidad. Mezclar bien.
9. Invierta y mezcle bien cada tubo antes de agregar la capa base de solución de gradiente de densidad isotónica al 70%. Inserte una pipeta serológica de 1 mL que contenga 1 mL de solución de gradiente de densidad isotónica al 70% en el fondo del tubo. Coloque lentamente 1 ml de la solución, teniendo cuidado de no hacer burbujas. Retire lentamente la pipeta serológica del tubo, teniendo cuidado de no alterar el gradiente.
   nota: Para la capa subyacente al 70%, la solución de gradiente de densidad isotónica al 100% debe diluirse al 70% utilizando medios RPMI (es decir, 7 mL de solución de gradiente de densidad isotónica al 100% y 3 mL de medios RPMI bien mezclados). Además, la creación de una capa de base limpia e inalterada del 70% es esencial para la eliminación de residuos de mielina y para obtener suspensiones unicelulares puras en la interfaz de gradiente después de la centrifugación.
10. Centrífuga a 800 x g durante 30 min a 4 °C sin freno. Aspire el sobrenadante, incluida la capa de restos de mielina, hasta que queden 2-3 ml en el tubo, teniendo cuidado de no alterar la capa celular. Recoja la capa celular entre el gradiente de densidad del 30/70% utilizando una pipeta de 1 mL y transfiérala a un nuevo tubo cónico de 15 mL.
11. Con una pipeta serológica de 10 mL, agregue medios RPMI 10% FCS para llevar el volumen final a 15 mL. Centrífuga 450 x g durante 5 min a 4 °C.
    nota: Durante este paso, las capas de células de dos tubos se pueden agrupar si es necesario. No agrupe más de dos tubos o las celdas no se granularán debido a una concentración de medios de gradiente de alta densidad.
12. Aspire el sobrenadante con cuidado para no alterar la pelletización de la célula. Vuelva a suspender las células en un volumen/tampón adecuado para contar las células utilizando un hemocitómetro (p. ej., resuspenda una sola médula espinal en 250 μL de tampón FACS para la tinción superficial posterior) (Figura 1).
13. Con una pipeta de 1 mL, transfiera las suspensiones celulares a la parte superior de un tubo superior del filtro (Tabla de materiales) y permita que las células se filtren al fondo del tubo para eliminar los restos de mielina restantes.
14. Usando tinte de exclusión azul de tripán, dilúyalo y cuente las células en un hemocitómetro promediando al menos dos cuadrículas de 16 cuadrados para mayor precisión40,41.
15. Proceda con la técnica de análisis de una sola célula deseada.
    nota: Utilizando diversas formas de colagenasa (es decir, D, tipo I, tipo II, tipo IV), las células inmunitarias, la microglía (Figura 1), los astrocitos, los pericitos, las células endoteliales49 y las neuronas50 pueden aislarse de forma eficiente. Los recuentos de células nucleadas obtenidos para los resultados fueron los siguientes utilizando la enzima colagenasa I titulada: Cerebro entero tratado con simulación = 500.000-600.000 células; Cerebro completo de TMEV-IDD = 800.000–1.000.000 de células; Médula espinal entera tratada con simulación = 150.000–200.000 células; Médula espinal completa de TMEV-IDD = 300.000–400.000. Los recuentos de células variarán dependiendo de la precisión de la recolección, el procesamiento y si hay inflamación del SNC.

Resultados

Figura 1: Identificación de células inmunitarias infiltrantes de CD45hi en tejidos del SNC. (A) Estrategia de activación para la identificación de células inmunitarias infiltrantes CD45hi (P1), microglía CD45lo (P2) y oligodendrocitos CD45-, astrocitos y neuronas entre el total de células vivas en la médula espinal de ratones tratados simuladamente (rojos) o TMEV-IDD (azules). Se detectaron célula...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Albúmina sérica bovina	ThermoFisher Scientific	37002D
centrífuga	Beckman Coulter	Centrífuga Allegra X-12R
Colagenasa I	Worthington	LS004196
Tubo cónico, 15 mL	VWR	525-1069
Tubo cónico, 50 mL	VWR	89039-658
Cubreobjetos	Hauser Científico	5000
Pinzas curvas	Herramientas de Bellas Ciencias	11003-14
Tubo de poliestireno desechable, 14 mL	Fisher Científico	14-959-1B
DNasa I	Worthington	LS002139
hielo seco	Gases aéreos	N/A
Durmont #7Forceps	Herramientas de Bellas Ciencias	11271-30
Sal disódica EDTA dihidratada	Amresco	0105-500g
Etanol, 100%	cualquier	N/A
Tubo superior del filtro, 5 mL	VWR	352235
Mancha de viabilidad reparable 780	Becton Dickinson	565388
glucosa	Fisher Chemical	D16-500
Solución salina de Hank (HBSS)	Corning	21-020-CV
Hemacitómetro	Andwin Científico	02-671-51B
Hemostático	Herramientas de Bellas Ciencias	13004-14
HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfónico)	ThermoFisher Scientific	15630080
Kcl	Fisher químico	BP366-500
KH2PO4 (anhidro)	Sigma Aldrich	P5655-100G
nitrógeno líquido	Gases aéreos	N/A
Bloque FC del ratón (CD16/32)	Becton Dickinson	553141
Na2HPO4 (anhidro)	Fisher Chemical	S374-500
NaCl	Fisher químico	S671-500
Aguja, calibre 25	Becton Dickinson	305122
Suero de ratón normal	ThermoFisher Scientific	31881
Colador de malla de nailon	VWR	352350
oct	Sakura	4583
Paraformaldehído, 20%	Ciencias de la Microscopía Electrónica	15713-S	Diluido al 4% usando 1 x PBS
Pipeta Pasteur, 9 pulgadas, desenchufada	Fisher Científico	13-678-20C
PBS (1x)	Corning	21-040-CV
PE Rata Anti-Ratón CD4	Becton Dickinson	553730
PE-CF594 Rata Anti-Ratón CD19	Becton Dickinson	562329
Medios de gradiente de densidad Percoll	GE Cuidado de la salud	17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rata Anti-Ratón CD45	Becton Dickinson	550994
Placa de Petri, 100 mm	VWR	353003
Medidor de pH	Fisher Científico	13-636-AB150
Pipet-Aid	Corporación Científica Drummond	4-000-101
Pipeta 200 μl	Gilson	FA10005M
Puntas de pipeta, 1 mL	Científico de EE. UU	Llame la atención al 1111-2831
Puntas de pipeta, 200 μl	Científico de EE. UU	1111-1816
Pipeta, 1 mL	Gilson	FA10006M
Montaje Prolong Diamond con DAPI	ThermoFisher Scientific	P36962
Rata purificada anti-ratón CD16/CD32	Becton Dickinson	553141
Conejo anti-ratón CD3 (clon SP7)	Abcam	AB16669
Laminina anti-ratón de conejo	Abcam	AB11575
Ratón anti-ratas ERT-R7	Abcam	AB51824
RPMI 1640	Corning	10-040-CV
Pipeta serológica, 1 mL	VWR	357521
Pipeta serológica, 10 mL	VWR	357551
Pipeta serológica, 5 mL	VWR	357543
hidróxido sódico	Fisher Científico	S318-100
sacarosa	Fisher químico	S5-500
Tijeras quirúrgicas	Herramientas de Bellas Ciencias	14001-16
Tijeras quirúrgicas, extrafinas	Roboz	RS-5882
Jeringa, 10 mL	Becton Dickinson	302995
Jeringa, 5 mL	Becton Dickinson	309646
Azul de tripano	Gibco	15250-061

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