Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Preparación de la lámpara de luz suave (día 1)
- Utilice una pizarra acrílica transparente con un grosor de 0,3-0,5 cm en el tamaño de papel A5. Pega almohadillas blancas en el anverso y el reverso de la placa acrílica.
- Instale una fila de luces LED blancas en el borde de la placa para que las luces puedan entrar por el costado de la placa acrílica y luego dispararse en paralelo (Figura 1A-F, Figura 2B).
nota: Dado que los diámetros de los EB en la etapa inicial son de aproximadamente 200 μm a 300 μm, es difícil observarlos claramente a simple vista bajo la lámpara fluorescente de bancos limpios. Por el contrario, debido a la mejora de la reflexión difusa, podemos detectar los EB claramente mediante el uso de luz suave iluminada lateralmente (Figura 2B, C). Se recomienda una placa de 6 pocillos para los cultivos de EB en experimentos posteriores. Sin embargo, para mostrar mejor el efecto visual de la luz suave, a veces se usan platos para tomar fotos y videos en este estudio en lugar de platos, así que no lo malinterprete. La lámpara de luz suave iluminada lateralmente también se puede utilizar para la placa de 6 pocillos.
2. Transferencia EB y reemplazo de medio (días 2-5)
- Prepare una nueva placa de baja adherencia de 6 pocillos y agregue 2 mL de medio de formación de cuerpo embrioide (EB) a cada pocillo.
- Retire los EB junto con el medio con una punta de pipeta de diámetro ancho de 1000 μL (consulte la tabla de materiales) y transfiéralos a la placa de baja adherencia de 6 pocillos (~100 EBs/pocillo).
nota: El proceso de operación adopta una lámpara de luz suave (mencionada en el paso 1) para que los EB sean más fáciles de observar. Apague otras fuentes de luz interior para mejorar el efecto visual de la luz suave.
- Reemplace con el mismo volumen de medio de formación EB fresco todos los días. Utilice el flujo secundario para reunir los EB en el centro y cambiar el medio.
- Aspire el medio viejo pipeteando lentamente hasta el borde del pozo. No chupe demasiado fuerte; de lo contrario, los EB se eliminarán juntos. A continuación, agregue un medio nuevo para volver a suspender el EBs.
nota: El flujo secundario principal (Figura 2D). Inducir un flujo de remolino girando el plato a lo largo de una órbita circular. Debido al flujo de remolino, se induce un flujo secundario y se dirige hacia el centro. Los EB u organoides convergen hacia el centro del pozo debido al flujo secundario generado a través de la rotación, después de lo cual se puede ejecutar fácilmente el cambio de medio o la transferencia de embrioides.
>3. Inducción neuronal (días 5-7)
- Prepare una nueva placa de 6 pocillos con baja adherencia y agregue 3 mL de medio de inducción neural (Tabla 1) a cada pocillo.
- Encienda la luz suave lateral (mencionada en el paso 1) y apague otras fuentes de luz interior.
- Transfiera los EB a la placa de 6 pocillos con medio de inducción neural agregado (~ 100 EB / pocillo). Agregue la menor cantidad posible del medio original al nuevo pocillo.
nota: Introducir habilidades sencillas de transferencia de organoides. Naturalmente, bajo gravedad y con una densidad relativamente mayor que el medio, los EB resuspendidos se hundirán gradualmente aplicando la operación que se muestra en la Figura 2E. Por lo tanto, los EB se pueden transferir cómodamente. Dado que, en comparación con las EB, las células libres y los fragmentos de células muertas se hunden más lentamente, la mayoría de las células libres y los fragmentos de células muertas pueden eliminarse mediante este método de sedimentación (Figura 2F).
- Incubar las muestras a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h.
nota: Bajo el microscopio, el diámetro de los EB era de aproximadamente 500 μm, y el borde era translúcido, lo que indicaba que se había formado una capa neuroepitelial.
Tabla 1. Composición del medio de inducción neural
| Componentes | volumen |
| DMEM-F12 | 97 mL |
| Suplemento de N2 | 1 mL |
| Suplemento Glutamax | 1 mL |
| MEM-NEAA | 1 mL |
| heparina | Concentración final 1 μg/mL |
