1. Preparación de medios de cultivo y herramientas
- Rocíe el banco y el área de trabajo con etanol al 70% y deje secar.
- Rocíe las herramientas de disección, las pinzas y los dos platos de vidrio con etanol al 70% y déjelos secar en el banco.
- Prepare los medios de Schneider suplementados (SSM, Tabla 1) y colóquelos en hielo.
- Pipetee 1 mL de SSM en cada una de las antenas de vidrio del reloj.
- Con una micropipeta con punta estéril, transfiera las larvas recién eclosionadas de la placa de PBS al SSM en la primera placa de reloj de vidrio. Con ayuda de una micropipeta con punta estéril, transfiera las larvas recién eclosionadas al SSM en la segunda placa de vidrio del reloj.
>2. Disecciones y cultivos cerebrales
- Una vez que las larvas estén en la segunda placa de vidrio con SSM, diseccione los cerebros de las larvas con pinzas y un microscopio de disección. Ajuste el aumento según sea necesario.
- Use una pinza para agarrar los ganchos de la boca y con la otra, agarre suavemente el cuerpo hasta la mitad y tire en la dirección opuesta (Figura 1) para dividir la larva en dos pedazos><.
nota: El cerebro se ubicará justo detrás de los ganchos bucales. Tenga en cuenta que puede haber otros tejidos que rodean el cerebro. Tenga mucho cuidado al extirpar estos tejidos, ya que puede dañar el cerebro.
- Una vez que se hayan diseccionado 15-20 cerebros, agregue 1 mL de SSM en un pocillo de una bandeja de cultivo estéril de 12 pocillos. Transfiera los cerebros recién diseccionados al SSM utilizando una micropipeta y una punta estéril (Figura 2A).
- Coloque los cerebros en el medio SSM en la bandeja de cultivo de 12 pocillos en una incubadora a 25 °C durante 24 h (Figura 2A).
Tabla 1: Receta para hacer medios de Schneider suplementados (SSM). La tabla enumera el volumen de todos los ingredientes necesarios para preparar 5 mL de SSM.
| Ingrediente (concentración inicial) | Para hacer 5 mL | Concentración final |
| Medios de comunicación de Drosophila de Schneider | 3.89 mL | |
| Suero fetal bovino (100%) | 500 μL< | 10% |
| Glutamina (200 mM) | 500 μL | 20 mM |
| Penicilina (5000 unidades/mL), Estreptomicina (50.000 μg/mL) | 100 μL | Pluma de 1000 U/mL, estreptococo de 1 mg/mL |
| Insulina (10 mg/mL) | 10 μL | 0,02 mg/mL |
| glutatión (50 mg/mL) | 5 μL | 0,05 mg/mL |
| En una campana estéril, utilizando una técnica estéril, agregue todos los ingredientes juntos en un tubo cónico de 14 mL. Colócalo en hielo hasta su uso. |
