Aislamiento de oligodendrocitos primarios murinos mediante perlas inmunomagnéticas

Resumen

Fuente: Flores-Obando, R. E. et al., Aislamiento inmunomagnético rápido y específico de oligodendrocitos primarios de ratón. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra un método para aislar células primarias de oligodendrocitos de una suspensión de células neuronales obtenida de una cría de ratón utilizando separación magnética. La técnica emplea perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos específicos contra los antígenos de los oligodendrocitos, lo que permite el aislamiento selectivo de estas células.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Disociación de la corteza cerebral del ratón

1. Sacrificio de crías de ratón C57Bl/6N postnatales de 5-7 días de edad mediante decapitación rápida con tijeras previamente limpiadas en etanol al 70%.
   nota: Para cada preparación se utilizaron cortezas cerebrales de 5-6 crías de ratones neonatos. En promedio, el cerebro de un ratón produce 1-1,5 x 10⁶ oligodendrocitos primarios (Ols).
2. Corta la piel del cuero cabelludo a lo largo de la línea media con unas tijeras diseccionadoras pequeñas y retírcala para exponer el cráneo.
3. Corta el cráneo con cuidado a lo largo de la línea media desde la abertura en la parte posterior del cráneo hacia el área frontal, levantando con las tijeras para evitar dañar el cerebro. Luego, usando la abertura en la parte posterior del cráneo, corte hacia cada cuenca del ojo a lo largo de la base del cráneo.
4. Use pinzas finas para separar suavemente las cortezas del mesencéfalo y transfiéralas a una placa de cultivo de tejidos de 60 mm que contenga 7 ml de B27NBMA. Repita los pasos 2.2 a 2.4 para cada cerebro, agrupando las cortezas disecadas.
5. Transfiera las cortezas a una nueva placa de cultivo de tejidos de 60 mm que contenga 5 mL de tampón de disociación (B27NBMA, 20-30 U/mL de papaína y 2.500 U de DNasa I).
6. Cortar las cortezas en trozos pequeños de aproximadamente 1^mm3 con una cuchilla de bisturí #15 e incubar durante 20 minutos en una incubadora de dióxido de carbono (CO₂) al 5% a 37 °C.
7. Añadir 1 mL de suero de crecimiento bovino (BGS) para detener la reacción enzimática.
8. Transfiera las cortezas junto con los medios de disociación a un tubo cónico de 15 mL utilizando una pipeta serológica de 10 mL.
9. Comience a disociar suavemente el tejido cerebral pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo de 6 a 8 veces con una pipeta serológica de 10 ml, teniendo cuidado de minimizar las burbujas.
10. Deje que los trozos de tejido se asienten durante 2-3 minutos y transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.
11. Agregue 3 mL de B27NBMA que contenga 10% BGS/2500 U DNasa I al pellet de tejido.
12. Utilice una pipeta serológica de 5 ml para disociar suavemente el tejido cerebral mientras pipetea hacia arriba y hacia abajo de 6 a 8 veces. Tenga cuidado de minimizar las burbujas.
13. Deje que los trozos de pañuelo se asienten durante 2-3 minutos.
14. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Añada 3 ml de B27NBMA que contenga un 10% de BGS/DNasa I al pellet de tejido.
15. Disocie suavemente el tejido cerebral con una punta de pipeta P1000, mientras pipetea la mezcla de medios y tejido cerebral hacia arriba y hacia abajo. Repita los pasos 2.13 y 2.14 hasta que no queden trozos grandes de tejido o hasta que se agoten B27NBMA que contengan un 10% de BGS/DNasa I, lo que ocurra primero. Tenga cuidado de minimizar las burbujas.
16. Suspensión de celdas de piscina con sobrenadantes previos.
17. Coloque un filtro de células de 70 μm en un tubo de 50 ml. Con una pipeta serológica de 10 ml, pase suavemente la suspensión de células agrupadas sobre el filtro de células de 70 μm.
18. Lave el filtro de células añadiendo 1 ml de B27NBMA que contenga un 10% de BGS/DNasa I.
19. Deseche el colador de celdas. Lleve el volumen a 30 ml con B27NBMA que contengan 10% de BGS/DNasa I.
20. Transfiera la suspensión celular a dos tubos cónicos de 15 mL. Centrifugar la suspensión celular durante 10 min a 200 x g.
21. Retire el sobrenadante sin dejar las células expuestas al aire. El sobrenadante estará turbio debido a los restos de la célula. Agregue 3 mL de B27NBMA que contenga 10% de BGS al pellet.
22. Disocie con cuidado el pellet de la célula con una pipeta P1000. Lleve el volumen a 15 ml con B27NBMA que contenga un 10% de BGS.
23. Pase la suspensión celular sobre un filtro celular fresco de 40 μm.
24. Lave el colador de células agregando 1 ml de B27NBMA que contenga 10% de BGS. Deseche el colador de celdas.
25. Lleve el volumen a 30 ml con B27NBMA que contengan un 10% de BGS.
26. Transfiera la suspensión celular a 2 tubos cónicos de 15 ml. Centrifugar la suspensión celular durante 10 min a 200 x g.
27. Retire la mayor parte del sobrenadante sin dejar las células expuestas al aire. Vuelva a suspender los gránulos de celda en 5 ml de tampón de clasificación de celdas magnéticas (MCS) helado.

>2. Determinación del recuento de células y viabilidad

1. Diluya 100 μL de la suspensión celular con 400 μL de solución de azul de tripano en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para lograr una dilución 1:5 en 0,4% (p/v).
2. Centre un cubreobjetos sobre una cámara de hemocitómetro y llene las dos cámaras con 10 μL de dilución celular utilizando una pipeta P10 y evitando el sobrellenado. La solución pasará por debajo del vidrio de cobertura por capilaridad.
3. Coloque el hemocitómetro en la platina del microscopio y ajuste el enfoque con un aumento de 40X.
   NOTA: Los recuentos de células se registran utilizando un contador de mano en cada uno de los cinco cuadrados (cuatro esquinas y un centro). Solo las células no viables absorben el tinte y aparecen de color azul, mientras que las células vivas y sanas aparecen redondas y refractivas y no absorben el tinte de color azul, lo que permite determinar el número de células viables y totales por mililitro.

3. Aislamiento de oligodendrocitos O4⁺

1. Centrifugar la suspensión celular a 200 x g durante 10 min.
2. Deseche cuidadosamente el sobrenadante mediante aspiración endouterina, evitando la exposición de las células al aire.
3. Vuelva a suspender el pellet en 90 μL de tampón MCS por 1 x 10⁷ células totales, seguido de la adición de 10 μL de perlas anti-O4 por 1 x 10⁷ células.
4. Mezcle la suspensión celular y las perlas moviendo suavemente el tubo cónico de 15 ml con el dedo 4-5 veces.
5. Incubar la mezcla durante 15 min a 4 °C, golpeando el tubo cónico de 15 mL con el dedo 4-5 veces cada 5 min.
6. Lave la mezcla añadiendo suavemente 2 mL de tampón MCS por cada 1 x 10⁷ células al tubo. Centrifugar la mezcla a 200 x g durante 10 min.
7. Deseche el sobrenadante utilizando cuidadosamente la aspiración endouterina, evitando la exposición de las células al aire. Vuelva a suspender el pellet de celda en 500 μL de tampón MCS por cada 1 x 10⁷ células.
8. Conecte un separador magnético a un soporte de separador magnético. Coloque una columna de selección en el separador magnético y coloque un filtro de células de 40 μm encima de la columna. Coloque dos tubos cónicos de 15 mL o uno de 50 mL debajo de la columna de separación para recoger el flujo.
9. Enjuague previamente el filtro de células de 40 μm y la columna de separación con 3 ml de tampón MCS y deje que el tampón corra a través de la columna sin dejar que se seque.
10. Agregue la mezcla de suspensión de celdas y cuentas al colador de celdas y en la columna de selección.
11. Lave el filtro de células de 40 μm con 1 ml de tampón MCS.
12. Deseche el colador de celdas y deje que la mezcla de celdas, perlas y tampón corra a través de la columna sin dejar que se seque.
13. Lave la columna de separación 3 veces con 3 mL de tampón MCS y 1 vez con medios de proliferación OL.
14. Retire la columna de separación del separador magnético, colóquela rápidamente en un tubo cónico de 15 ml e inmediatamente agregue 5 ml de medio de proliferación OL.
15. Coloque un émbolo en la parte superior de la columna y empuje firmemente para enjuagar las células marcadas en el tubo cónico de 15 ml.
16. Extraer 100 μL de suspensión celular para determinar el recuento celular y la viabilidad utilizando azul de tripán y hemocitómetro como se indica en la sección 3.
    NOTA: La viabilidad celular superior al 80% se considera aceptable para proceder con el cultivo de OLs, pero la viabilidad superior al 90% es óptima.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pipetas serológicas de 10 ml	Fisher Científico	13-676-10J
Jeringa de 10 ml con punta Luer-Loc	BD, Becton Dickinson	309604
Tubos cónicos de 15 ml	halcón	352097
Placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos	halcón	353935
Filtro de células de 40 μm	Fisher Científico	22368547
Tubos cónicos de 50 ml	halcón	352098
Pipetas serológicas de 5 ml	Fisher Científico	13-676-10H
Placas de cultivo de tejidos de 60 mm	halcón	353002
Filtro de células de 70 μm	Fisher Científico	22363548
Perlas anti-O4- Anti-O4MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-094-543
Conjunto completo de filtro de tapa de botella Autofil, filtro de 0,22um, 250 ml	Científico de EE. UU	6032-1101
Conjunto completo de filtro de tapa de botella Autofil, filtro de 0,22um, 250 ml	Científico de EE. UU	6032-1102
Suplemento B27	Invitrogen	17504-044
Suero de crecimiento bovino (BGS)	GE Healthcare Ciencias de la Vida	SH30541.03
Bsa	Fisher Científico	BP-1600-100
CNTF	Peprotech	450-50
Desoxirribonucleasa I (ADNasa I)	Worthington	LS002007
EDTA	Fisher Científico	S311
Bisturíes desechables de plumas	Andwin Científico	EF7281C
glucosa	Fisher Científico	D16-1
GlutaMAX	Invitrogen	35050-61
insulina	Invitrogen	12585-014
Soporte separador magnético - MACS multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Separador magnético-Separador MiniMACS	Miltenyi Biotec	130-042-302
Unidad de filtro Millex PES de 0,22 μm	Millipore	SLG033RS
Medio neurobasal A	Invitrogen	10888-022
papaína	Worthington	LS003126
PBS sin Ca2+ y Mg2+	sigma	D5652
Solución madre DNase I			1. Disolver a 12.500 U de desoxirribonucleasa I / ml en HBSS enfriado sobre hielo. 2. Filtro esterilizar en hielo 3. Alícuota a 200 μl y congelar durante la noche a -20 °C. 4. Almacene las alícuotas a una temperatura de -20 a -30 °C.
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (sin Ca2+ y Mg2+)			Disuelva la bolsa en 1 litro de agua para producir 1 litro de medio a 9,6 gramos de polvo por litro de medio. Conservar a una temperatura de entre 2 y 8 °C.
Solución de Trypan Blue	Corning	25-900-CI
B27NBMA			487,75 mL de medio neurobasal A; 10 mL de suplemento de B27; 1 mL de Primocina; 1,25 mL de Glutamax; Filtrar, esterilizar y almacenar a 4 °C hasta su uso.
B27NBMA + 10% BGS			27 mL B27NBMA; 3 mL Suero de crecimiento bovino
Stock de solución CNTF (10 μg/ml; 1000X)			Pedido de Peprotech (450-50). Enrasar de 0,1 a 1 mg/ml según las instrucciones del fabricante (puede variar de un lote a otro) en tampón (por ejemplo, DPBS + 0,2% BSA). Almacenar a -80 °C. Solución de trabajo (10 μg/ml, 1000X) 1. Hacer con 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) en solución DPBS y filtro esterilizante. 2. Diluir la alícuota de la materia prima a 10 μg/ml en estéril, refrigerado al 0,2% BSA/DPBS. 3. Alícuota (20 μl/tubo) y congelación instantánea en nitrógeno líquido. 4. Almacene las alícuotas a -80 °C.
Búfer de clasificación de celdas magnéticas (MCS)			Prepare la solución que contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2 y albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5%, 0,5 mM de EDTA, 5 μg/ml de insulina, 1 g/L de glucosa. Esterilizar y desgasificar por filtración el tampón haciéndolo pasar a través de un filtro Millex de 0,22 μm. Almacene el tampón a 4 °C hasta su uso
Sales equilibradas de Hank (HBSS) (Sigma			1. Mida 900 ml de agua (temperatura 15-20 °C) en un cilindro y remueva suavemente. 2. Agregue la potencia y revuelva hasta que se disuelva. 3. Enjuague el paquete original con una pequeña cantidad de agua para eliminar todos los rastros del polvo. 4. Agregue a la solución en el paso 2. 5. Añadir 0,35 gr de bicarbonato de sodio (7,5% p/v) por cada litro de volumen final. 6. Siga revolviendo hasta que se disuelva. 7. Ajuste el pH del tampón mientras agita a 0,1-0,3 unidades por debajo de pH = 7,4, ya que puede aumentar durante la filtración. Se recomienda el uso de HCl 1N o NaOH 1N para ajustar el pH. 8. Agregue agua adicional para llevar el volumen final a 1L. 9. Esterilizar por filtración utilizando una membrana con una porosidad de 0,22 micras. 10. Almacenar a 2-8 °C.