Preparación de un sustrato micropatronado para el estudio de los fenotipos de las células de Schwann

Resumen

Fuente: Xu, Z., Orkwis, et al. Preparación de Microambientes de Matriz Extracelular Sintonizables para Evaluar la Especificación del Fenotipo de la Célula de Schwann. J. Vis. Exp. (2020).

El video describe la preparación de un sustrato micromodelado para estudiar la especificación del fenotipo celular. Se utiliza un sello PDMS con micropatrones recubiertos de proteínas para transferir el micropatrón en un cubreobjetos recubierto de PDMS. A continuación, el cubreobjetos se trata con un tensioactivo para dificultar la adhesión de las células en las superficies no deseadas. A continuación, se añaden células para que se asienten en el patrón y se incuban para su posterior análisis.

Protocolo

1. Preparación y caracterización de sustratos de cultivo celular sintonizables

1. Preparación del sustrato
   1. Mezcle vigorosamente el elastómero base de polidimetilsiloxano (PDMS) y los agentes de curado con una punta de pipeta en una proporción entre 10:1 y 60:1 hasta que las burbujas se dispersen homogéneamente dentro de la mezcla. Elimine las burbujas mediante desecación al vacío hasta que se disipen.
      NOTA: Durante la polimerización de PDMS, el agente de curado se retiñe con el elastómero base para proporcionar las propiedades mecánicas deseadas del polímero final. Las relaciones de reticulación se pueden ajustar para alterar la rigidez del PDMS.
   2. Coloque una gota (~0,2 mL) de la mezcla de PDMS desecada en un cubreobjetos cuadrado o circular (por ejemplo, 22 mm x 22 mm) y gire el cubreobjetos en un recubridor giratorio a 2500 rpm durante 30 s.
   3. Incubar el cubreobjetos en un horno a 60 °C durante 1-2 h o a temperatura ambiente durante la noche para que el PDMS se solidifique.
   4. Trate el cubreobjetos con un limpiador de ozono UV durante 7 min (longitud de onda UV: 185 nm y 254 nm) para aumentar la hidrofilicidad de la superficie. Colóquelo en una placa esterilizada de 6 pocillos.
   5. Antes >PRECAUCIÓN: El limpiador UV-Ozono puede generar ozono que es dañino para los humanos. Trabaje en una campana extractora de gases químicos o con algún tipo de ventilación.
2. Preparación de sustratos micropatrones
   1. Dibuje la geometría deseada y las áreas adhesivas de las celdas (900 μm², 1.600 μm² y 2.500 μm²) utilizando un software de diseño asistido por ordenador (CAD). Crea una fotomáscara cromada basada en esos patrones de un proveedor comercial.
   2. En una sala limpia o en un entorno libre de polvo, utilice técnicas estándar de fotolitografía para fabricar obleas de silicio. Los parámetros críticos para esta aplicación en particular son los siguientes: Fotorremansión: SU-8 2010; Perfil de giro para dispersar la fotorresistencia: 500 rpm durante 10 s con una aceleración de 100 rpm/s, luego 3500 rpm durante 30 s con una aceleración de 300 rpm/s; Energía de exposición a la luz UV: 130 mJ/cm2.
      NOTA: La altura de los patrones en las obleas de silicio es de aproximadamente 10 μm siguiendo estos parámetros. Las posibles grietas alrededor del borde fuera de los patrones rectangulares o triangulares se pueden ver usando un microscopio óptico después del paso 1.2.2. Hornear la oblea de silicona a 190 °C durante 30 minutos ayuda a eliminar las grietas.
   3. Coloque la oblea de silicio estampada dentro de una placa de Petri circular de 150 mm de diámetro x 15 mm de altura y vierta PDMS desgasificado (proporción de mezcla 10:1) como se preparó en el paso 1.1.1 sobre la oblea de silicio.
      NOTA: Asegúrese de que el grosor del PDMS sea de al menos 5 mm para facilitar el manejo durante los pasos de impresión por microcontacto.
   4. Solidifique el PDMS en una oblea de silicona en un horno a 60 °C durante la noche. Deje que el PDMS se enfríe a temperatura ambiente. Corta con precisión sellos cuadrados de 30 mm x 30 mm que contienen los patrones correctos de la oblea de silicona con un bisturí quirúrgico. No dañe la oblea de silicona.
      NOTA: Las obleas de silicona se pueden reutilizar muchas veces en este punto para producir más sellos después de la limpieza con isopropanol.
   5. Esterilice los sellos PDMS y los cubreobjetos sintonizables (preparados en los pasos 1.1.1 a 1.1.3) sumergiéndolos en etanol al 70% durante 30 min.
   6. Para confirmar la eficacia del micropatrón de los sellos PDMS después de la impresión por microcontacto, seque la superficie de los sellos PDMS con una corriente de aire filtrada y pipetee 50 μg/mL de solución de albúmina sérica bovina (BSA) (conjugada con Texas Red) para cubrir todo el lado estampado del sello PDMS.
   7. Incubar los sellos de PDMS con solución BSA durante 1 h a temperatura ambiente para permitir la adsorción de proteínas.
   8. Seque la superficie de los cubreobjetos sintonizables utilizando una corriente de aire filtrada y aumente la hidrofilicidad de la superficie como se describe en el paso 1.1.5.
   9. Seque al aire los sellos PDMS para eliminar la solución BSA restante.
      NOTA: Tenga cuidado de que la solución BSA se retire completamente del sello porque cualquier solución restante hará que los sellos se deslicen en el cubreobjetos durante la impresión por microcontacto.
   10. Ponga el lado estampado del sello en contacto conforme con el cubreobjetos sintonizable para la adsorción de BSA en la superficie del cubreobjetos. Presione suavemente el sello contra el cubreobjetos durante 5 min.
       NOTA: No aplique una fuerza excesiva sobre el sello, ya que se doblará y causará un contacto inespecífico entre el sello y el cubreobjetos. La cantidad adecuada de fuerza aplicada al sello es esencial para el éxito de la impresión por microcontacto.
   11. Examine el micropatrón utilizando un microscopio de fluorescencia con un filtro FITC (isotiocianato de fluoresceína).
   12. Para imprimir áreas adhesivas de celdas en lugar de patrones fluorescentes, sustituya la proteína BSA por laminina y repita los pasos 1.2.5 a 1.2.10.
   13. Retire los sellos de los cubreobjetos y transfiéralos a una placa esterilizada de 6 pocillos. Agregue 2 mL de solución Pluronic F-127 al 0,2% p/v en cada pocillo para cubrir la superficie del cubreobjetos e incube durante 1 h a temperatura ambiente><. NOTA: Pluronic F-127 se puede adsorber a la superficie del PDMS, lo que aumenta la hidrofobicidad de la superficie del PDMS para bloquear la adhesión de las células.
   14. Aspire la solución de Pluronic F-127 y lave 5 veces con solución salina tampón de fosfato (PBS) y 1 vez con el medio de cultivo celular antes de sembrar las células. Una densidad de siembra típica para las SC es de 1.000 células/^cm2.
   15. 45 minutos después de la siembra de células, retire el medio de cultivo celular y lave los cubreobjetos con PBS 2x para evitar que varios SC se adhieran al mismo patrón. Mantenga las células en el entorno de cultivo celular deseado durante 48 h antes de la cuantificación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Albúmina de suero bovino (BSA), conjugado rojo de Texas	Thermo Fisher Scientific	A23017	Tinción de BSA para mostrar micropatrones
Dulbecco's Modified Eagle Medio	Thermo Fisher Scientific	11965092	Medio de cultivo celular
Suero Fetal Bovino	Thermo Fisher Scientific	16000044	Suplementario de medio de cultivo celular
Fibronectina	Thermo Fisher Scientific	33010-018	Proteína utilizada para recubrir cubreobjetos
Microscopio de fluorescencia	Nikon	Eclipse Ti2	Microscopio de fluorescencia
Laminina	Thermo Fisher Scientific	23017015	Proteína utilizada para recubrir cubreobjetos
Penicilina-Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	Suplementario de medio de cultivo celular
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P-2443	Bloquear la unión a proteínas no específicas
SYLGARD 184 PDMS base y agente de curado	Sigma Aldrich	761036	Polímero sintonizable utilizado para recubrir cubreobjetos
Limpiador UV-Ozono	Novascan		Aumentar la hidrofililidad de PDMS