Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Aislamiento y cultivo de fibroblastos nerviosos motores y sensoriales y SC (células de Schwann)
- Utilice ratas Sprague-Dawley (SD) de siete días de edad (n = 4) del Centro de Animales Experimentales de la Universidad de Nantong de China. Coloque las ratas en un tanque que contenga un 5% de isoflurano durante 2-3 minutos, permita que los animales respiren lentamente y no tengan actividad independiente, y luego desinfecte con etanol al 75% antes de la decapitación.
- Use unas tijeras para cortar la piel de la espalda unos 3 cm y retire la columna vertebral. Abra el canal vertebral con cuidado para exponer la médula espinal.
- Mantenga la médula espinal en una placa de Petri de 60 mm con 2-3 mL de solución salina equilibrada (HBSS) de D-Hanks helada.
- En función de la estructura anatómica, extirpe la raíz ventral (nervio motor) y luego la raíz dorsal (nervio sensorial) bajo un microscopio de disección. A continuación, colóquelos en una solución salina equilibrada (HBSS) de D-Hanks helada.
- Después de retirar el HBSS, cortar los nervios en trozos de 3-5 mm con unas tijeras y digerir con 1 ml de tripsina al 0,25% (p/v) a 37 °C durante 18-20 min. A continuación, complemente con 3-4 ml de DMEM que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS) para detener la digestión.
- Pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo suavemente unas diez veces y centrifugar a 800 x g durante 5 min. Después de eso, deseche el sobrenadante y suspenda el precipitado en 2-3 mL de DMEM suplementado con 10% de FBS.
- Filtrar la suspensión celular con un filtro de malla 400, luego inocular las células en una placa de Petri de 60 mm y cultivar a 37 °C en 5% de CO2. Después de 4-5 días de cultivo, aislar los fibroblastos de paso 0 (p0) y los SC después de alcanzar el 90% de confluencia.
- Aislamiento y cultivo de SCs (Figura 1)
- Lave las celdas una vez con 1x PBS. Añadir 1 mL de tripsina al 0,25% (p/v) (37 °C) por placa de Petri de 60 mm para digerir las células durante 8-10 s a temperatura ambiente. Después de eso, se agregaron 3 mL de DMEM suplementado con 10% de FBS para detener la digestión.
- Sople suavemente la mezcla con una pipeta para separar los SC. A continuación, recoja y centrifugue los SC a 800 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante y suspenda el residuo en 3 mL de DMEM con 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, 2 μM de forskolina y 10 ng/mL de HRG, y luego inocular las células en una placa de Petri de 60 mm sin recubrimiento. Después de cultivar a 37 °C durante 30-45 min, los fibroblastos (algunos fibroblastos se digieren con SC) se adhieren al fondo de la placa.
- Transfiera el sobrenadante (incluyendo los SCs) a otra placa de medio recubierta de poli-L-lisina (PLL) y cultive a 37 °C durante 2 días.
