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1. Preparación de cultivo endotelial de ratón en insertos de soporte permeables
NOTA: Las celdas BEND3 se mantienen de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Prepare el medio celular (BM) BEND3 agregando 50 mL de FBS y 5 mL de penicilina-estreptomicina en 500 mL de DMEM y mezcle bien.
- Aspire el medio del plato y lave el cultivo celular BEND3 con 1 mL de PBS una vez. Añadir 1 mL de tripsina-EDTA (ácido etilendiaminado tetraacético) al 0,25% a las células e incubarlas durante 4 min a 37 °C.
- Agregue 1 mL de BM a las células para neutralizar la tripsina-EDTA y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para disociar completamente las células. Transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo cónico de 15 mL y granule por centrifugación a temperatura ambiente (RT) durante 5 min a 400 x g.
- Aspire el sobrenadante del tubo y vuelva a suspender las células con 9 mL de BM fresco, luego agregue 1 mL de suspensión celular en un inserto de soporte permeable. Agregue otros 2 mL de BM fresco por pocillo en la cámara inferior de la matriz. Continúe cultivando las células durante un día.
2. Configuración del cocultivo neuroendotelial y el sistema de etiquetado Ac4ManNAz
- Un día, después de colocar las células BEND3 en los insertos, aspire suavemente el medio en la cámara inferior primero y luego los insertos. Lave la cara de los insertos 3 veces con DMEM precalentado (medio de águila modificado de Dulbecco). Lave la superficie exterior de los insertos enjuagando con DMEM precalentado.
- Agregue 1 mL de AM precalentado (medio adherente) en un inserto, luego transfiera los insertos a los pocillos con células corticales primarias. Incubar el cocultivo a 37 °C y 5% de CO2 durante 12 h.
- Disuelva Ac4ManNAz en DMSO (dimetilsulfóxido) para lograr una concentración de stock de 200 mM. 12 h después de establecer el cocultivo neural-endotelial, agregue 1 μL de stock de Ac4ManNAz por cámara inferior y 0,5 μL de stock por inserto en el cocultivo. Agite los platos inmediata y suavemente para mezclar bien el medio. Para las celdas de control, agregue un volumen igual de DMSO.
- Cultivar las células durante otros 5 días a 37 °C y 5% de CO2. Prepare la AM con 10x bFGF como medio de realimentación (RM). Durante este tiempo, agregue 100 μL de RM por inserto y 200 μL de RM por cámara inferior para realimentar las células endoteliales y neurales cada dos días. Durante la realimentación, no suministre Ac4ManNAz o DMSO en el cultivo.