Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Soluciones y medicamentos
- Solución salina fisiológica (PSS)
- Prepare un mínimo de 1 L de PSS utilizando 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 10 mM de N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico (HEPES) y 10 mM de glucosa.
- Preparar las soluciones necesarias que carecen de CaCl2 (cero Ca2 + PSS) para la disección de las arteriolas cerebrales y el aislamiento del tubo endotelial.
nota: Prepare todas las soluciones en H2O desionizado ultrapuro, seguido de filtración (0,22 μm). Asegúrese de que el producto final contenga un pH de 7,4 con osmolalidad entre 290 y 300 mOsm.
- Albúmina sérica bovina (BSA, 10%)
- Disuelva 1 g del polvo de BSA liofilizado en un vaso de precipitados de 10 mL de cero Ca2+ PSS. Cubra el vaso de precipitados y espere al menos 2 horas agitando lentamente para que el BSA se disuelva.
- Filtre la solución con una jeringa de 10 ml más un filtro de 0,22 μm y prepare alícuotas de 1 ml para almacenarlas a -20 °C.
- Solución de disección
- Agregue 500 μL de BSA (10%) a 49,5 mL de cero Ca2+ PSS para un volumen total de 50 mL.
- Transfiera la solución a una placa de Petri para disecciones arteriolares.
- Solución de disociación
- Agregue 5 μL de solución de CaCl2 (1 M) y 500 μL de BSA (10%) a 49,5 mL de cero Ca2+ PSS para un volumen total de 50 mL. Incubar la solución a temperatura ambiente durante al menos 1 h.
- enzimas
- Prepare 1 mL de solución de digestión con 100 μg/mL de papaína, 170 μg/mL de ditioeritritol, 250 μg/mL de colagenasa (mezcla Tipo H) y 40 μg/mL de elastasa.
nota: Las actividades enzimáticas pueden variar, aunque es probable que los protocolos exitosos requieran las siguientes actividades enzimáticas: ≥ 10 unidades/mg para la papaína, ≥ 1 unidad/mg para la colagenasa y ≥ 5 unidades/mg para la elastasa.
>2. Aislamiento de las arteriolas parenquimatosas
NOTA: Las arteriolas que surgen de las arterias cerebrales medias (ACM) e incrustadas en el parénquima cerebral se eligen para este protocolo. Las arteriolas se aíslan como se ha descrito anteriormente11, con modificación.
- Utilice clavijas de acero (diámetro: 0,2 mm, longitud: 11 a 12 mm) para asegurar el cerebro aislado en una solución de disección fría en una placa de Petri que contenga un recubrimiento de polímero de silicona con infusión de carbón vegetal (profundidad ≥ 50 cm).
- Con unas tijeras de disección afiladas y alineadas, corte un rectángulo de tejido cerebral (longitud: 5 mm, ancho: 3 mm) (Figura 1B) alrededor del ACM mientras se asegura de que la parte superior del segmento de tejido esté más allá del punto de ramificación del Círculo de Willis. Corta otro rectángulo de tejido cerebral del otro hemisferio del cerebro para acceder a más arteriolas si es necesario.
- Asegure el segmento de tejido cerebral separado en el plato con el MCA hacia arriba (distal del círculo de Willis) con alfileres de acero (diámetro: 0,1 mm, longitud: 13 a 14 mm). Con cuidado, haga una incisión poco profunda cerca de los clavos para extraer la pia con pinzas pequeñas, despegándola suavemente de un extremo hacia el otro (Figura 1C). Retire la pia del otro segmento de tejido para acceder a más arteriolas si es necesario. Asegure cuidadosamente la pia aislada con arteriolas parenquimatosas ramificadas de MCA en el plato con los clavos, y diseccione las arteriolas parenquimatosas (Figura 1D), asegurándose de que las arteriolas no estén dañadas.
nota: Si las arteriolas no se extraen fácilmente con la pia del parénquima, use pinzas finas y excave en el cerebro, comenzando en el punto de ramificación de MCA desde el Círculo de Willis. Localice la arteriola, afloje con cuidado el tejido alrededor de las arteriolas (Figura 1E) y extraiga suavemente la arteriola del parénquima, sosteniendo el extremo superior de la arteriola (Figura 1F). Se pueden aislar múltiples arteriolas (longitud: ~1,5-2 mm) de un rectángulo de tejido cerebral.
- Asegúrese de que la arteriola esté limpia, sin tejido adherido a ella, y corte las ramas distales restantes (Figura 2A). Utilice esta arteriola limpia e intacta para la digestión enzimática. Alternativamente, corte cada arteriola en dos pedazos (longitud: 0,75-1 mm) para la digestión enzimática para la preparación de tubos endoteliales si lo desea.
>3. Digestión de las arteriolas parenquimatosas y preparación de los tubos endoteliales
- Disposición de equipos y pipetas
nota: El aislamiento de los tubos endoteliales arteriales del cerebro ha sido descrito previamente13,18. El protocolo actual incorpora modificaciones para el aislamiento del endotelio de las arteriolas parenquimatosas (intracerebrales). Se pueden usar múltiples arteriolas y/o pedazos de arteriolas juntas para la digestión enzimática.
- Montar el aparato de trituración13 para la preparación de tubos endoteliales utilizando una platina de aluminio que soporta una cámara y micromanipuladores. Monta un microscopio equipado con objetivos (5x-60x) y una cámara conectada a un monitor de ordenador. Asegure una microjeringa con un controlador de bomba junto a la platina y la muestra.
- Fije una pipeta de trituración rellenada con aceite mineral sobre el pistón de la microjeringa. Utilice la microjeringa con el controlador de la bomba para extraer la solución de disociación en la pipeta de trituración (~130 nL) sobre el aceite mineral, teniendo cuidado de evitar burbujas de aire en la pipeta.
- Digestión parcial de los segmentos arteriolares
- Coloque los segmentos arteriolares intactos en 1 mL de solución de disociación en un tubo de vidrio de 10 mL que contenga 100 μg/mL de papaína, 170 μg/mL de ditioeritritol, 250 μg/mL de colagenasa y 40 μg/mL de elastasa. Incubar los segmentos arteriolares a 34 °C durante 10-12 min.
- Después de la digestión, reemplace la solución enzimática con 3-4 mL de solución de disociación fresca a temperatura ambiente.
- Aislamiento del tubo endotelial arteriolar
NOTA: Después de la digestión y el reemplazo de la solución enzimática, transfiera uno o varios segmentos parcialmente digeridos a la solución de disociación en una cámara de superfusión conectada a una plataforma móvil. Mientras observa con un aumento de 100x a 200x, seleccione un segmento de vaso parcialmente digerido pero intacto y concéntrelo bajo el microscopio.
- Coloque la pipeta de trituración conectada al inyector de microjeringa en la solución de disociación de la cámara y colóquela cerca de un extremo del segmento del recipiente digerido. Establezca una tasa dentro del rango de 1-3 nL/s en el controlador de la bomba para una trituración suave.
- Mientras mantiene un aumento de 100x a 200x, extraiga el segmento arteriolar en la pipeta y luego expulse para disociar las células adventicias y musculares lisas (Figura 1B). Triturar el segmento del vaso hasta que todas las células del músculo liso se disocien y solo queden las células endoteliales como un "tubo" intacto
nota: Si es necesario durante la trituración, use cuidadosamente pinzas de punta fina para eliminar la adventicia disociada y la lámina elástica interna del tubo endotelial. Por lo general, solo unos pocos ciclos de trituración producen un tubo endotelial intacto.
- Utilice micromanipuladores para asegurar cada extremo del tubo endotelial en el cubreobjetos de vidrio en la cámara con pipetas de fijación de vidrio de borosilicato (Figura 2C, D).
- Fijación del tubo endotelial arteriolar
- Reemplace la solución de disociación con una solución de superfusión (PSS que contenga 2 mM de CaCl2) mientras se asegura de que el material no endotelial se lave fuera de la cámara.
- Transfiera el tubo endotelial asegurado en la plataforma móvil al equipo de microscopio diseñado para la superfusión continua y las grabaciones/imágenes intracelulares o fluorescentes.
- Aplique la administración continua de PSS durante el experimento. Ajuste manualmente el caudal (5-7 mL/min) durante todo el experimento utilizando la válvula de control de flujo en línea, consistente con el flujo laminar, mientras hace coincidir la alimentación del flujo de solución con el grado de succión al vacío. Espere ≥5 min de flujo de PSS a la cámara para la superfusión del tubo endotelial antes de adquirir los datos de fondo y/o la carga de colorante.
