Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Disección del disco intervertebral bovino
- Enjuague bien toda la cola con agua del grifo para eliminar la suciedad y el pelo de la superficie.
nota: Con los extremos distales intactos, se puede utilizar un máximo de 9 discos intervertebrales (IVDs) (coxígeos 1-9) por cola para los experimentos, dependiendo del tamaño deseado de los IVDs. Considerando el diámetro deseado entre 15-20 mm, utilizamos 12 colas bovinas con 5 IVDs por cola para los experimentos.
- Sumerge toda la cola en una caja que contenga solución de betadine al 1% durante 10 min. Seca brevemente la cola con una gasa estéril y colócala sobre un paño estéril.
nota: Durante la disección del disco, humedezca las colas con la gasa humedecida en solución de Ringer para evitar la deshidratación. Guarde las colas (o los segmentos sobrantes) envueltos en una gasa húmeda hasta que se complete todo el procedimiento de disección.
- Utilice un bisturí (n.º 20) para extraer el tejido blando de la columna caudal lo más completamente posible para facilitar la identificación de los IVD. Retire las apófisis espinosas y transversales de las vértebras con alicates de extracción de hueso.
nota: Seleccione los IVD con el diámetro deseado. En el presente estudio se utilizaron DIV con un rango de diámetro de 15-20 mm.
- Corte transversalmente con alicates de hueso a través del centro de cada cuerpo vertebral para obtener segmentos de movimiento individuales. Coloque los segmentos de movimiento en una placa de Petri con gasa humedecida con la solución de Ringer.
- Localice el IVD y la vértebra por palpación y moviendo suavemente los segmentos de movimiento. Haga dos cortes paralelos con la sierra de cinta en la placa de crecimiento de los IVD, uno a cada lado del IVD. Identifique la ubicación de la placa de crecimiento tocando y encontrando el sitio convexo de la parte ósea de la placa terminal (dura) adyacente al disco (blanda) con una distancia de seguridad de aproximadamente 0,5-1 mm desde el IVD hacia la vértebra. Asegúrese de que la hoja de la sierra de cinta se enfríe con la solución de Ringer mientras corta las vértebras.
- Transfiera los IVD en una placa de Petri limpia con una gasa limpia humedecida con la solución de Ringer.
nota: La gasa debe humedecerse y no demasiado mojada para evitar la hinchazón de los IVD,
- Use la hoja del bisturí para raspar el cuerpo vertebral (hueso rojo/rosa), la placa de crecimiento (cartílago blanco), deje la placa terminal intacta (amarillo-rosa). Haga que las dos superficies sean planas y paralelas para el procedimiento de carga. Transfiera los IVD raspados a una placa de Petri fresca con gasa humedecida con la solución de Ringer.
nota: Use un guante de cota de malla para proteger la mano mientras sostiene el IVD y raspa.
- Mida la altura y el diámetro del disco con una pinza. Limpie los coágulos de sangre en el hueso de las vértebras con la solución de Ringer utilizando un sistema de lavado a chorro.
- Transfiera los IVD a tubos de plástico de 50 mL, un IVD por tubo. Añadir 25 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) + 10% de penicilina/estreptomicina (P/S) por día de diagnóstico in vitro y dejar agitar durante 15 min en un agitador orbital a temperatura ambiente.
- Aspire el sobrenadante y agregue 10 mL de PBS + 1% P/S por IVD durante 2 min para enjuagar los IVD.
>2. Cultivo y carga IVD
- Transfiera los discos a las cámaras de diagnóstico in vitro y agregue medio de cultivo para diagnóstico in vitro (medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, 4,5 g/L de DMEM de alta glucosa para el grupo fisiológico y 2 g/L de DMEM de baja glucosa para el grupo patológico) + 1% P/S + 2% de suero fetal de ternero + 1% ITS (contiene 5 μg/mL de insulina, 6 μg/mL de transferrina, y 5 ng/mL de ácido selenio) + 50 μg/mL de ascorbato-2-fosfato + 1% de aminoácidos no esenciales + 50 μg/mL de agente antimicrobiano para células primarias) y colocar en una incubadora a 37 °C, 85% de humedad y 5% de CO2.
- Cultivar los discos durante 4 días dentro de un sistema de biorreactor según grupos experimentales. En el grupo patológico, mantener las condiciones de carga degenerativa a 0,32-0,5 MPa, 5 Hz durante 2 h/día. En el grupo de control fisiológico, utilice un protocolo de carga de 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz durante 2 h/día.
nota: Coloque los IVD en cámaras que contengan 5 mL de medio IVD durante los procedimientos de carga. El volumen depende del tamaño de las cámaras de carga del biorreactor. Entre los procedimientos de carga, coloque los IVD en placas de seis pocillos con 7 mL de medio de cultivo IVD para la recuperación de la hinchazón libre.
- Para analizar los cambios en la altura del disco durante el período experimental, mida la altura del disco con un calibrador después de la disección IVD (línea de base) y luego diariamente después del período de hinchamiento libre y después de la carga dinámica durante la duración experimental.
