Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en neuronas utilizando lentivirus modificados

Abstract

Fuente: Assetta, B., et al., Generación de neuronas humanas y oligodendrocitos a partir de células madre pluripotentes para modelar las interacciones neurona-oligodendrocitos. J. Vis. Exp. (2020).

Este video demuestra el proceso de inducir células madre pluripotentes humanas para diferenciarse en neuronas transfectándolas con lentivirus modificados genéticamente que llevan un gen de factor de transcripción neurogénico bajo el control de un elemento sensible a la tetraciclina, seguido de un tratamiento con un derivado de tetraciclina y un medio de maduración.

Protocol

1. Inducción de neuronas humanas a partir de células madre pluripotentes humanas

1. Preparación de lentivirus (~5 días, protocolo detallado como se describió anteriormente)
   1. Coloque ~ 1 millón de células HEK293T en cada matraz T75 para que tengan ~40% de confluente al realizar la transfección. Transfectarlos con plásmidos que expresen Ngn2 inducible por tetraciclina y el gen resistente a puromicina (PuroR; bajo el mismo control del promotor de TetO), rtTA, y los tres plásmidos auxiliares pRSV-REV, pMDLg/pRRE y VSV-G (12 μg de ADN del vector lentiviral y 6 μg de cada uno de los ADN del plásmido auxiliar). Prepare al menos tres frascos por preparación de lentivirus. Use PEI para la transfección siguiendo las instrucciones del fabricante. Cambie el medio después de 16 h y deséchelo.
   2. Coseche las partículas virales liberadas recolectando medios de cultivo todos los días y reemplácelos con medios frescos durante 3 días. Agrupe los medios recolectados que contienen partículas virales para su purificación. Filtrar el virus a través de un filtro de 0,22 μm y centrifugar a 49.000 x g durante 90 min. Vuelva a suspender el pellet en el volumen adecuado de PBS-glucosa (~150 μL).
2. Inducción de neuronas (~5 días)
   nota: Este protocolo de inducción (Figura 1A; diagrama de flujo) es altamente efectivo para las células iPS y ES de pluripotencia validada (que se pueden analizar mediante tinción inmunohistoquímica de marcadores de pluripotencia bien caracterizados; Figura 1B).
   1. Utilice células madre embrionarias humanas H1 disponibles comercialmente en el paso de 52 (véase la Tabla de Materiales). Cultive las células en placas de 6 pocillos recubiertas de solución de matriz extracelular (~0,5 mg de solución de matriz por placa de 6 pocillos; ver Tabla de Materiales) utilizando medio de mantenimiento de células ES (ver Tabla de Materiales) e incubar las placas a 37 °C con 5% de CO₂.
   2. En el día -2, separe las células madre embrionarias (80% confluentes) con 1 mL de solución de desprendimiento de células (ver Tabla de Materiales) e incube a temperatura ambiente durante 10 min. Transfiera las células a un tubo; lave el pocillo con 2 mL de medio y combine en el mismo tubo. Centrifugar a 300 x g durante 5 min, volver a suspender el pellet en el medio y colocar las células en placas de 6 pocillos recubiertas de matriz con una densidad de siembra de 1 x 10₅ celdas por pocillo.
   3. En el día -1, agregue lentivirus que expresen Ngn2 más PuroR y rtTA junto con polibreno (8 μg/ml) a las células madre embrionarias en un medio de mantenimiento fresco para células madre embrionarias (ver Tabla de materiales). La cantidad exacta de virus debe determinarse mediante títulos reales o la titulación. Por lo general, agregamos 5 μL de cada virus por pocillo en una placa de 6 pocillos.
   4. En el día 0, añadir doxiciclina (2 μg/mL para activar la expresión de Ngn2) en medio DMEM-F12 con suplemento de N2 sin morfógenos.
   5. El día 1, agregue puromicina en medio fresco de DMEM-F12 más N2 y doxiciclina, hasta la concentración final de medio de 1 μg/mL. Seleccione las células transducidas en puromicina durante al menos 24 h. Es posible que se requiera una concentración más alta de puromicina (hasta 5 μg/mL) y un período de selección más largo (hasta 48 h) para eliminar adecuadamente las células subtransducidas si el título del virus es bajo.
   6. En el día 2, separe las neuronas diferenciadoras con solución de desprendimiento de células (ver Tabla de Materiales), vuelva a colocarlas en placas de 24 pocillos (entre 80.000 y 200.000 células/pocillo) recubiertas con solución de matriz (ver Tabla de Materiales) y manténgalas en medio NBA/B27 sin doxiciclina. La densidad de siembra es crítica.
   7. En esta etapa, las neuronas desprendidas pueden congelarse en un medio de congelación comercial especializado (ver Tabla de Materiales) y almacenarse en nitrógeno líquido hasta por 3 meses. Las neuronas puras se pueden platear teniendo en cuenta la típica muerte celular de ~ 15% a 20% después del deshielo, cultivadas solas o cocultivadas con otros tipos de células cerebrales.
   8. Cultivo de iNs puros en las placas recubiertas con soluciones extracelulares basadas en matrices según las instrucciones del fabricante (véase la tabla de materiales). La morfología piramidal característica debería ser evidente para el día 4 (y el día 6; Figura 1C). La formación de sinapsis se puede detectar ya entre los días 14 y 16 y es prominente en el día 24 mediante tinción inmunohistoquímica con marcadores pre y postsinápticos estándar. (Figura 1D; marcado con el marcador presináptico Sinapsina 1 y el marcador dendrítico Map2).

Results

Figura 1: Generación directa de neuronas inducidas por el hombre (iNs) a partir de hPSCs. (A) Diagrama de flujo de generación de iN. (B) Imágenes representativas de campo claro e inmunofluorescencia del inicio del cultivo de células madre pluripotentes humanas (H1) para confirmar la pluripotencia. Oct4 se muestra en rojo y Sox2 en verde. (C) Imáge...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	Tecnologías STEMCELL	7920
Suplemento de B27	ThermoFisher	17504044
DMEM/F12 medio	Tecnologías STEMCELL	36254
Dmso	ThermoFisher	D12345
doxiciclina	MilliporeSigma	D3072
Células madre embrionarias humanas H1	WiCell (Célula Inalámbrica	WA01
Matrigel	Corning	354234
mTeSR plus	Tecnologías STEMCELL	5825
Suplemento de N2	ThermoFisher	17502001
Medio neurobasal A	ThermoFisher	10888-022
Aminoácidos no esenciales	ThermoFisher	11140-050
Pei	VWR	71002-812
pMDLg/pRRE	Addgene	12251
Polibreno	MilliporeSigma	TR-1003-G
pRSV-REV	Addgene	12253
Puromicina	ThermoFisher	A1113803
STEMdiff Progenitor Neural Medios de Congelación	Tecnologías STEMCELL	5838
Kit de inducción neuronal STEMdiff SMADi	Tecnologías STEMCELL	8581
Tempo-iOlogo: OPC derivadas de iPSC humanas	Tempo BioScience	SKU102
TetO-Ng2-Puro	Addgene	52047
VSV-G	Addgene	12259