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1. Diferenciación neuronal
NOTA: Realice los pasos 1.1 - 1.5 antes del mediodía y el paso 1.7 después del mediodía. En la Figura 1A se presenta una descripción general de los procedimientos de diferenciación.
- Transfiera 350 μl (3,5 x 106) de ESC a una placa de baja fijación de 10 cm que contenga 25 ml de medio de diferenciación. Colóquelo en un agitador orbital ajustado a 30 - 45 rpm dentro de una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C con 5% de CO2. Este es el primer día de diferenciación, denominado día in vitro (DIV) -8,
nota: El uso de una placa de fijación ultra baja aumenta el costo del método, pero produce rendimientos ligeramente mayores que las placas de Petri bacterianas, ya que los agregados pueden adherirse ocasionalmente a las placas de Petri. Si se prefieren diferentes tamaños de platos, los volúmenes medianos y los números de celdas se pueden escalar en consecuencia.
- Después de 48 horas (DIV -6), utilice una pipeta de 25 ml para transferir los agregados celulares diferenciadores a un tubo cónico de 50 ml. Agregue inmediatamente 25 ml de medio de diferenciación fresco a la placa de Petri.
- Deje que los agregados se asienten durante 2 a 5 minutos, produciendo un pellet visible de 1 a 2 mm de profundidad. Ignore las células individuales o los agregados pequeños que permanecen en suspensión. Aspire con cuidado el medio y transfiera el pellet de celda de vuelta a la placa de Petri con un P1000. Coloque en un agitador giratorio en una incubadora de cultivo de tejidos.
- En DIV -4, repita el paso 1.2. El pellet tendrá entre 2 y 4 mm de profundidad. Sustituya 30 ml de medio de diferenciación suplementado con 6 μM de ácido retinoico (AR) totalmente trans por la placa de Petri. Regrese al agitador giratorio en la incubadora de cultivo de tejidos durante 48 horas adicionales.
- En DIV -2, repita el paso 1.3. El pellet tendrá entre 4 y 8 mm de profundidad en este punto.
- En DIV -1, prepare las superficies de recubrimiento como en la Sección 2.
- En DIV 0, descongele 5 ml de medio de tripsinización NPC prealícuota y congelado a 37 °C durante 5 a 10 min y colóquelo en una campana de cultivo de tejidos. Con una pipeta de 25 ml, transfiera los agregados diferenciadores a un tubo cónico de 50 ml. Deje que los agregados se asienten y aspire cuidadosamente el medio. Lave el pellet dos veces con 10 ml de PBS, permitiendo que los agregados se asienten entre lavados.
- Después del segundo lavado con PBS, añadir 5 ml de medio de tripsinización NPC al pellet e incubar a 37 °C durante 5 min. Agitar suavemente el tubo después de 2,5 min.
- Añadir 5 ml de inhibidor de tripsina (ITS) de soja al 0,1% para inactivar la tripsina y mezclar invirtiendo. Triturar suavemente de 10 a 15 veces con una pipeta serológica de 10 ml hasta obtener una suspensión celular relativamente homogénea.
- Transfiera lentamente la suspensión celular a un filtro celular de 40 μm o 70 μm colocado en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml. Una vez filtrada toda la suspensión, añadir 1 ml de medio N2 para lavar las células restantes a través del filtro y pellet la suspensión celular disociada durante 6 min a 200 x g.
- Aspire el medio sin alterar el pellet. Lavar las celdas dos veces con 10 ml de medio N2, peletizar las celdas durante 5 min a 200 x g y triturar entre lavados con un P1000. Antes del segundo lavado, cuente las células con un hemocitómetro.
- Vuelva a suspender las células en medio N2 a 1 x 107 células por ml y paje las ESN a una densidad de células de 150.000 a 200.000 células/cm2.
- Transfiera las NSG recién sembradas a una incubadora de cultivo de tejidos humidificada a 37 °C y 5% de CO2 y manténgalas como en la sección 3.
>2. Preparación de superficies de cultivo para el recubrimiento de precursores neuronales en DIV 0
- Prepare platos tratados con cultivo de tejidos al menos 1 día antes de la siembra. Añadir suficiente polietileneimina (PEI; 25 μg/ml en H2O estéril) o poli-D-lisina (PDL; 100 μg/ml en H2O estéril) para cubrir las placas de plástico tratadas con cultivo de tejidos e incubar O/N a 37 °C.
- En la mañana del emplatado, lave los platos dos veces con H2O bidestilado y una vez con PBS. Después del lavado final, agregue suficiente medio N2 para cubrir el plato (por ejemplo, 1 ml por pocillo de un plato de 12 pocillos o 4 ml por plato de 6 cm).
- Prepare cubreobjetos de vidrio de 18 mm al menos un día antes del recubrimiento de neuronas. Limpie los cubreobjetos mediante limpieza con plasma durante 4 min.
- Transfiera inmediatamente los cubreobjetos limpios a un parafilm lavado con etanol en el fondo de un plato estéril grande y agregue 400 μl de solución de PEI o PDL, preparada como en el paso 2.1. Incubar O/N a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos.
- Por la mañana, lavar las cubreobjetos tres veces con agua y añadir 5 μg/ml de laminina en PBS durante 1 a 3 horas a 37 °C. Antes de disociar las neuronas, aspirar la laminina y transferir inmediatamente el cubreobjetos a un pocillo de un plato de 12 pocillos que contenga 1 ml de medio NPC, asegurándose de mantener el lado tratado hacia arriba.
- Guarde los platos y cubreobjetos a 37 °C hasta que los NPC estén listos para emplatar.
>3. Mantenimiento de las neuronas
- En DIV 1, aspire el medio y reemplácelo con el medio de cultivo N2.
- En DIV 2 y 4, aspire el medio y reemplácelo con el medio de cultivo B27.
- En DIV 8, aspire el medio y reemplácelo con un medio de cultivo B27 que contenga inhibidores mitóticos para eliminar las células no neuronales contaminantes.
- En DIV 12, sustitúyase por el medio de cultivo B27.
- No retire los ESN DIV 12+ del 5% de CO2 hasta que esté listo para usar.
