Diferenciación de células madre embrionarias de ratón en una población de neuronas en red

Resumen

Fuente: Hubbard, K. et al., Evaluación funcional de neurotoxinas biológicas en cultivos en red de neuronas del sistema nervioso central derivadas de células madre.J. Vis. exp. (2015).

Este video muestra una técnica para la diferenciación de células madre embrionarias en una población en red de neuronas con sinapsis funcionales. Describe los pasos involucrados en la diferenciación de células madre embrionarias en neuronas, la inducción de la formación de redes neuronales y el enriquecimiento del cultivo con neuronas en red.

Protocolo

1. Diferenciación neuronal

NOTA: Realice los pasos 1.1 - 1.5 antes del mediodía y el paso 1.7 después del mediodía. En la Figura 1A se presenta una descripción general de los procedimientos de diferenciación.

1. Transfiera 350 μl (3,5 x 10⁶) de ESC a una placa de baja fijación de 10 cm que contenga 25 ml de medio de diferenciación. Colóquelo en un agitador orbital ajustado a 30 - 45 rpm dentro de una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C con 5% de CO₂. Este es el primer día de diferenciación, denominado día in vitro (DIV) -8,
   nota:

Resultados

Figura 1. Las ESN adaptadas a la suspensión permanecen mitóticamente estables y expresan marcadores de pluripotencia.(A) Esquema de mantenimiento y diferenciación de ESC. La presencia o ausencia de ácido retinoico (AR) o factor inhibidor de la leucemia (LIF) se marca con un + o –. Se proporciona una comparación entre los días in vitro (DIV) y las etapas clásicas de desarroll.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM de eliminación	Tecnologías de la Vida	10829-018	Medio: Medio de cultivo ESC Formulación y notas: 500 mL
100x MEM NEAA	Tecnologías de la Vida	11140-050	Medios: almacenar a 4 °C hasta 1 mes Formulación y notas: 6 mL
200 mM de L-Alanil-L-Glutamina	ATCC	30-2115	6 mL
FBS calificado por ES	Célula madre aplicada	ASM-5007	90 mL
100x antibióticos	Sigma-Aldrich	A5955	3 mL
55 mM 2-mercaptoetanol	Tecnologías de la Vida	21985-023	1.1 mL
107 Unidades/mL LIF	Millipore	ESG1107	60 μL
DMEM de eliminación	Tecnologías de la Vida	10829-018	Medio: Medio de diferenciación ESC Formulación y notas: 436,6 mL
100x MEM NEAA	Tecnologías de la Vida	11140-050	Medios: almacenar a 4 °C hasta por 1 mes Formulación y notas: 5 mL
200 mM de L-Alanil-L-Glutamina	ATCC	30-2115	5 mL
Suero con certificación ESC	Célula madre aplicada	ASM-5007	50 mL
100x antibióticos	Sigma-Aldrich	A5955	2.5 mL
55 mM 2-mercaptoetanol	Tecnologías de la Vida	21985-023	0,9 ml
PBS de Dulbecco	Sigma-Aldrich	D8537	Medio: Medio de tripsinización NPC Formulación y notas: 100 mL
0,5 M EDTA (18,3%)	Sigma-Aldrich	3690	Medio: congelación en 5 mL alícuota Formulación y notas: 0,266 mL
tripsina	Sigma-Aldrich	T8802	50 mg
Polietileneimina (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	Medios: Soluciones de recubrimiento de superficies Formulación y notas: 2,5 μg/mL en H20
Poli-D-lisina (PDL)	Sigma-Aldrich	P7280	Medios: usar dentro de 1 semana Formulación y notas: 100 μg/mL en H20
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020	5 μg/mL en H20
DMEM/F12 + GlutaMAX	Tecnologías de la Vida	10565-018	Medio: Medio de cultivo NPC Formulación y notas: 492.5 mL
100x vitaminas N2	Tecnologías de la Vida	17502-048	Medios: almacenar a 4 °C hasta por 1 mes Formulación y notas: 5 mL
100x antibióticos	Sigma-Aldrich	A5955	2.5 mL
Neurobasal A	Tecnologías de la Vida	10888-022	Medio: Medio de cultivo ESN Formulación y notas: 482.5 mL
50 vitaminas B27	Tecnologías de la Vida	17504-044	Medios: almacenar a 4 °C durante un máximo de 1 mes Formulación y notas: 10 mL
200 mM de L-Alanil-L-Glutamina	ATCC	30-2115	5 mL
100x antibióticos	Sigma-Aldrich	A5955	2.5 mL
5-fluoro-2'-desoxiuridina (5FDU)	Sigma-Aldrich	F0503	Medios: 2000x Inhibidores mitóticos alícuota y almacenamiento a -20 °C Formulación y notas: dd 150 mg 5FDU y 350 mg uridina a 10 mL Neurobasal A. Filtro estéril, alícuota y congelación. Utilice 2000x en el medio de cultivo ESN.
uridina	Sigma-Aldrich	U3003
TrypLE Express Tripsina	Tecnologías de la Vida	12605-010	Medios: Miscelánea Formulación y notas: almacenar en RT
Dmso	Sigma-Aldrich	D8418	tienda en RT
inhibidor de la tripsina de la soja (ITS)	Sigma-Aldrich	T6414	almacenar a -20 °C
etanol	Sigma-Aldrich	E7023	tienda en RT
ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	A4403	Prepare 100 mM de caldo disolviendo 100 mg de ácido ascórbico en 5,7 mL de mezcla 50:50 de DMSO/etanol.
ácido retinoico (AR)	Sigma-Aldrich	R2625	Resuspender 15 mg de AR en 9 mL 50:50 DMSO/etanol. Complementar con 1 mL de 100 mM de caldo de ácido ascórbico. Alícuota y almacenado a -80 °C. Estable durante 6 meses.
Limpiador de plasma	Harrick Plasma	PDC-32G
Microscopio invertido Olympus IX51	Olimpo	N/A
Cubreobjetos de vidrio de 18 mm	pescador	12-545-84
filtro de células (40 μm)	pescador	08-771-1
Agitador Stovall Danza del Vientre	pescador	Teléfono 15-453-211
Platos de baja adherencia	pescador	05-539-101	Corning 3262
Placas bacterianas	VWR	25384-302	100 x 15 mm