Separación magnética de las células de Schwann de los nervios ciáticos de ratón

Resumen

Fuente: Blusch, A., et al., Mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglios de raíz dorsal de rata y células de Schwann. J. Vis. Exp. (2023)

Este video muestra un método para aislar células de Schwann de fibras del nervio ciático de ratón.

Protocolo

1. Cultivo de células de Schwann

1. Recubrimiento para el cultivo de células de Schwann
   1. Cubra las placas de cultivo celular en condiciones estériles. Aplicar 2 mL de poli-L-lisina (PLL) al 0,01% en dos placas de cultivo de tejidos (TC) de 60 mm cada una e incubar durante la noche a 4 °C.
   2. Retirar el PLL, lavar las placas TC 2 veces con agua destilada e incubar con 2 mL de laminina de 1 μg/^cm2 durante la noche a 4 °C. Lavar las placas TC 2 veces con agua y dejar que las placas se sequen al aire.
2. Medio de preparación para el cultivo de células de Schwann
   1. Prepare 50 mL de medio celular de Schwann agregando 10% de suero fetal de ternera (FCS) inactivado por calor, 2 μM de forskolina, 10 nM de neuregulina y 50 μg/mL de gentamicina al Medio de Águila Modificado de Dulbecco (DMEM)/F-12 (alta glucosa) en condiciones estériles.
   2. Prepare 70 mL de medio L-15 de Leibovitz con 50 μg/mL de gentamicina en condiciones estériles.
3. Digestión enzimática del nervio ciático
   NOTA: Los siguientes pasos se realizan en condiciones estériles.
   1. Prepare la solución de digestión enzimática que contiene 0,25% de dispasa II, 0,05% de colagenasa tipo I y 50 μg/mL de gentamicina en 10 mL de DMEM (glucosa alta).
   2. Centrifugar el tubo a 188 x g durante 5 min a 4 °C, retirar el sobrenadante con una pipeta serológica de 25 mL y transferir el pellet con el medio Leibovitz L-15 restante a una placa de cultivo de tejidos de 60 mm utilizando una pipeta de 1.000 mL.
   3. Enjuague el tubo de 50 mL con 10 mL de la solución enzimática de digestión y agréguelo al plato que contiene las fibras nerviosas. Distribuya el tejido en el plato cuidadosamente con la punta de una pipeta para maximizar la superficie accesible para la digestión.
   4. Incubar a 37 °C y 5% de CO₂ durante 18 h, y detener la digestión añadiendo 10 mL de FCS al 40% en solución salina balanceada de Hanks, sin Ca²⁺ y Mg²⁺ (HBSS).
4. Separación celular
   1. Transfiera los nervios digeridos a un tubo de 50 mL utilizando una pipeta serológica y una centrífuga a 188 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 mL de DMEM que contiene 10% de FCS y 50 μg/mL de gentamicina. Vuelva a suspender el pellet 20 veces posteriormente, utilizando una punta de pipeta de 10 ml, 5 ml, 2 ml, 1 ml y 200 μl.
   2. Filtrar la suspensión celular a través de un filtro celular de 100 μm y centrifugar a 188 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con 4 mL de DMEM que contenga 10% de FCS y 50 μg/mL de gentamicina.
   3. Añada 2 mL de la suspensión celular a cada una de las dos placas TC de 60 mm recubiertas de PLL y laminina, e incube a 37 °C y 5% de CO₂. Deje las placas intactas durante 2 días en la incubadora para proteger las células del estrés mecánico y apoyar la adherencia.
5. Diferenciación de células de Schwann
   1. Después de 2 días, retire el medio y enjuague cuidadosamente las placas 2 veces con DMEM (glucosa alta), FCS al 10% y gentamicina de 50 μg/mL. A continuación, añada 2 ml de medio celular de Schwann. Reemplace el medio celular de Schwann cada 2 días y observe la apariencia y confluencia de la célula con un microscopio.
6. Tripsinización celular y separación magnética
   1. Cuando las células alcancen una confluencia de aproximadamente el 80% (6-12 días de cultivo), lavar cuidadosamente las placas 2 veces con 3 mL de DPBS e incubar con 2 mL de tripsina/EDTA al 0,05% (precalentado a 37 °C) durante 3 min. Cuando las células se desprenden del fondo de la placa, inactiva la digestión mediante la adición de 2 mL de DMEM con 10% de FCS y 50 μg/mL de gentamicina.
      nota: Cíñete a un tiempo de tripsinización de estrictamente 3 minutos, y procede rápidamente después.
   2. Vuelva a suspender el pellet de célula en 2 mL de tampón de separación de células magnéticas que contenga DPBS con 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 2 nM de EDTA. Combine 10 μL de la suspensión celular con 10 μL de azul de tripán y cuente las células usando una cámara de tinción.
   3. Centrifugar la suspensión celular a 188 x g durante 10 min a 4 °C y volver a suspender el pellet de celda en 90 μL de tampón de separación celular magnética por 1 x 10⁷ celdas. Añadir 10 μL de microperlas Thy-1 por cada 1 x 10⁷ células. Vuelva a suspender la solución unas cuantas veces e incube durante 15 minutos en la oscuridad a 8 °C.
   4. Añadir 2 mL del tampón de separación de células magnéticas a la suspensión de células y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 μL de tampón de separación de células magnéticas.
   5. Humedezca la columna de separación de células magnéticas con 1 ml del tampón de separación de células magnéticas. Coloque la columna de separación de celdas magnéticas en el separador de celdas magnéticas. Aplique las celdas a la columna de separación de celdas magnéticas. Recoja el flujo y centrifugue a 300 x g a 4 °C durante 10 min.
      nota: Los fibroblastos se seleccionan positivamente y permanecen en la columna, mientras que las células de Schwann pasan por la columna. Los fibroblastos se pueden recolectar con un sello (p. ej., como control negativo para los protocolos de tinción de células de Schwann).
   6. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL del medio de cocultivo. Cuente las células después de la tinción con azul de tripano y una cámara de tinción.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Albúmina sérica bovina	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	8076.4
Filtro de células, 100 μM	BD Bioscience, Heidelberg, Alemania	352360
centrífuga 5810-R	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania	5811000015
incubadora de CO2 Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Alemania	51017865
Dispasa II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania	4942078001
Agua destilada (sistema de purificación de agua)	Millipore, Molsheim, Francia	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania	31331093
DPBS (sin iones de calcio y sin iones de magnesio)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania	D8537-6X500ML
Fcs	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania	F7524	El FCS debe probarse para el cultivo de células de Schwann
Gentamicina	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania	5710064
HBSS (sin iones de calcio y sin iones de magnesio)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania	14170138
Laminina	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania	L2020-1MG
MACS Multistand	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania	130042303
Microtijeras	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemania	15000-08
microscopio	Motic, Wetzlar, Alemania	Motic BA 400
Portaobjetos de microscopio	VWR, Radnor, Estados Unidos	630-1985
Separador MiniMACS	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania	130091632
Columnas MS	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania	130-042-201
Cámara de recuento Neubauer	Asistente, Erlangen, Alemania	40441
Pipetas	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania	2231300004
Poli-L-lisina	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania	P4707-50ML
Pipeta serológica, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Alemania	861254025
Pipeta serológica, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Alemania	861685001
Pipeta serológica, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Alemania	861253001
Antena TC 60, celda +	Sarstedt, Nümbrecht, Alemania	833901300
Microperlas Thy-1 (Kit MACS)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania	130-094-523
Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania	25300-054
Colagenasa tipo I	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania	Hacia 1639
Baño de agua tipo 1008	GFL, Burgwedel, Alemania	4285