$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Preparación de solución de corte con alto contenido de sacarosa y líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF)
- Antes de la jornada experimental
- Prepare 1 L de presolución de 10 rebanadas con agua Tipo 1 de grado de laboratorio que contenga (en mM): 25 KCl, 20 CaCl2, 10 MgSO4, 12.5 KH2PO4 (Tabla 1). Para evitar la precipitación de fosfato de calcio, mezcle lentamente los productos químicos en un vaso de precipitados precargado con 800 mL H2O mientras agita constantemente con un agitador magnético. Almacene la solución a 4 °C o a temperatura ambiente (RT).
- En la jornada experimental
- Prepare 1 L de 1x ACSF con agua de tipo 1 de grado de laboratorio que contenga (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgSO4, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 25 Glucosa (Tabla 2). Utilice un osmómetro de presión de vapor para validar la osmolaridad entre 305-315 mOsm (pH ~ 7,55-7,6).
nota: Para evitar la precipitación de fosfato de calcio, mezcle lentamente todos los productos químicos sólidos en un vaso de precipitados precargado con 800 mL deH2O mientras agita constantemente con un agitador magnético. Agregue MgSO4 y CaCl2 al final, goteando lentamente en la cantidad necesaria de soluciones madre de 1 M.
- Burbujee continuamente 1x solución de ACSF en RT con carbógeno para establecer el pH entre 7,3 y 7,4.
nota: Si el pH es ligeramente demasiado alto o demasiado bajo, pequeños ajustes en la fuerza de la carbogenación serían suficientes. Si el pH es superior a 7,45 con carbogenación, ajústelo añadiendo unas gotas de solución 1 M NaH2PO4.
- Prepare 250 mL (por cerebro) de 1x solución de corte con alto contenido de sacarosa en un vaso de precipitados que contenga 25 mL de presolución de 10x corte y (en mM): 252 Sacarosa, 26 NaHCO3 y 10 Glucosa (Tabla 3). Verifique que la osmolaridad esté entre 320 y 325 mOsm (pH ~ 7,55 a 7,6).
- Burbujee la solución de rodajas con alto contenido de sacarosa durante 10 a 15 minutos con carbógeno para controlar el pH entre 7,3 y 7,4.
nota: Si el pH es superior a 7,45 con carbogenación, ajústelo añadiendo unas gotas de solución 1 M KH2PO4.
- Guarde la solución de rodajas con alto contenido de sacarosa durante 20-30 minutos en el ultracongelador (-80 °C) hasta que esté parcialmente congelada.
>2. Disección y posicionamiento del cerebro murino
- Transfiera el cerebro a la placa de cultivo refrigerada de 35 mm y elimine todas las partículas de pelo o sangre del tejido lavando suavemente el cerebro con una pipeta Pasteur rellena de ACSF (la sangre tiene efectos citotóxicos en el tejido cerebral).
- Transfiera el cerebro con la ayuda de la espátula sobre el papel de filtro empapado sobre la placa de cultivo enfriada de 90 mm (Figura 1A).
- Use una cuchilla para cortar el cerebro por la mitad, separando los dos hemisferios, y coloque ambos hemisferios en el lado medial recién cortado.
- Use una cuchilla para extraer la parte dorsal (5%–10%) del cerebro de cada hemisferio con un corte paralelo a la parte superior dorsal (Figura 1C) y coloque ambos hemisferios en el lado recién cortado con la parte ventral del cerebro hacia arriba.
- Coloque una gota de superpegamento en la placa de muestra y extiéndala correctamente con la punta de una pipeta para acomodar ambos hemisferios.
- Use una correa de papel de filtro para recoger un hemisferio con fuerzas capilares tocando el lado ventral con la correa de papel de filtro, para no dañar el tejido.
- Use otra correa de papel de filtro para semisecar cuidadosamente el lado dorsal del cerebro antes de colocar el hemisferio, con el lado dorsal hacia abajo, encima del pegamento en la placa de muestra. Repita el mismo procedimiento con el segundo hemisferio.
nota: Los hemisferios deben colocarse en alineación horizontal en forma de espejo en la placa del vibrátomo, con los lados rostrales apuntando hacia el exterior y los lados caudales enfrentados (pero sin tocarse) entre sí en el medio. Los lados mediales de ambos hemisferios deben apuntar hacia la hoja del vibrátomo y los lados laterales hacia el experimentador (Figura 1D).
- Coloque la placa de muestra en la cámara de corte y cúbrala rápida pero cuidadosamente con granizado de solución de rodaja con alto contenido de sacarosa helada. Tan pronto como la solución toque el pegamento, se solidificará y pegará correctamente los hemisferios a la placa de muestra.
- Asegúrese de que los hemisferios estén correctamente cubiertos con una solución de rodajas con alto contenido de sacarosa y confirme que la solución esté burbujeada con carbógeno.
nota: Todo el procedimiento de disección debe realizarse lo más rápido posible. Asegúrese de que el cerebro no se quede sin el suministro de oxígeno durante mucho tiempo. Debería tomar solo alrededor de 1 a 1,5 minutos desde la decapitación hasta la inmersión cerebral en el fango de la solución de rodajas con alto contenido de sacarosa. Este es el requisito más crítico para las preparaciones agudas de cortes de cerebro con el fin de garantizar una alta calidad del corte.
3. Corte horizontal del cerebro
- Coloque la hoja del vibrátomo frente al lado medial de los hemisferios y bájela a la misma altura que los lados ventrales de los hemisferios que ahora están hacia arriba. Baje la cuchilla con la ayuda del control de vibratomo a 600 μm más en la dirección dorsal y comience a cortar. La cuchilla debe golpear el tejido (si no, invierta la cuchilla y bájela un poco más). Corta hasta que las dos primeras rodajas estén completamente separadas de los dos hemisferios.
- Invierta la cuchilla y baje otros 300 μm y vuelva a cortar.
- Cuando el hipocampo se haga visible (use el atlas del cerebro del ratón para obtener ayuda, si es necesario) (Figura 1E) recoja las rodajas con la pipeta Pasteur de plástico ensanchada. Recoja las rodajas hasta que el putamen caudado se haga visible junto al hipocampo. Por lo general, se pueden recolectar entre 8 y 12 cortes de 300 μm (4 a 6 por hemisferio) para el cerebro del ratón.
- Utilice la pipeta de plástico Pasteur para recoger las rodajas y transferirlas a la cámara de recuperación en el baño de agua (Figura 1F) (recoja las rodajas después de cada ronda de corte para evitar que floten en la cámara de cortes).
nota: Trabaje lo más rápido posible y asegúrese de que la solución de rodajas con alto contenido de sacarosa esté helada y carbugenada durante todo el procedimiento. Si es necesario, vuelva a llenar el hielo que rodea la cámara de cortes.
>4. Recuperación de cortes de cerebro para registros electrofisiológicos
- Deje las lonchas en la cámara de recuperación llena de ACSF en el baño de agua a 32 °C durante 1 h.
NOTA: Las cámaras de recuperación también están disponibles comercialmente.
- Saque la cámara de recuperación del baño de agua.
- Coloque las rodajas en RT durante al menos otros 30 minutos para recuperarlas antes de comenzar cualquier aplicación adicional.
Recetas de búfer y medios.
Tabla 1: 10 x pre-solución en rodaja (1 L).
| compuesto | Concentración (mM) | Peso molecular (g/mol) | Cantidad (g) |
| Kcl | 25 | 74.55 | 1.86 |
| CaCl2 * 2H2O | 20 | 147.01 | 2.94 |
| MgSO4 * 7H2O | 10 | 246.48 | 2.46 |
| KH2PO4 | 12.5 | 136.08 | 1.7 |
Tabla 2: 1x ACSF (1 L) (osmolaridad entre 305–315 mOsm).
| compuesto | Concentración (mM) | Peso molecular (g/mol) | Cantidad (g) |
| NaCl | Artículo 125 | 58.44 | 7.3 |
| Kcl | 2.5 | 74.55 | 0.19 |
| CaCl2 * 2H2O | número arábigo | de 1 M de solución de CaCl2 | 2 mL |
| MgSO4 * 7H2O | 1 | de 1 M de solución de MgSO4 | 1 mL |
| NaH2PO4 * 2H2O | 1.25 | 156.02 | 0.2 |
| NaHCO3 | 26 | 84.01 | 2.18 |
| Glucosa * H2O | 25 | Artículo 198.17 | 4.95 |
Tabla 3: 1x solución de corte con alto contenido de sacarosa (250 mL) (osmolaridad entre 320–325 mOsm).
| compuesto | Concentración (mM) | Peso molecular (g/mol) | Cantidad (g) |
| Presolución de corte 10x | N/A | N/A | 25 mL |
| sacarosa | Artículo 252 | Artículo 342.3 | 21.57 |
| NaHCO3 | 26 | 84.01 | 0.55 |
| Glucosa * H2O | 10 | Artículo 198.17 | 0.49 |
