Generación de cortes de amígdala inclinados a partir de un cerebro de ratón

En este artículo

Resumen

Fuente: Bosch, D., et al. Disección Optogenética Ex Vivo de Circuitos de Miedo en Cortes de Cerebro. J. Vis. Exp. (2016)

El video muestra la generación de cortes de amígdala inclinados a partir del cerebro de un ratón. El cerebro se coloca en ángulo en la etapa de muestra de vibratomo para obtener cortes que contienen la amígdala y los axones de la corteza prefrontal medial que forman conexiones sinápticas con la amígdala. Los trozos de cerebro se mantienen a la temperatura fisiológica para preservar el tejido para futuros experimentos.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Preparación de Cortes Agudos

Prepare líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF), solución de corte, herramientas (tijeras, bisturí, pinzas, espátula, pipeta Pasteur) y bloques de agar.
Nota: Se requiere 1 L de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) por experimento, y se prepara disolviendo productos químicos en H₂O bidestilado como se publicó anteriormente. La solución de corte se prepara suplementando 200 ml de ACSF con 0,87 ml de solución madre de 2 M MgSO₄.
Oxigenar ACSF y solución de corte durante todo el experimento con 95% de_O2 y 5% de_CO2.
Anestesiar profundamente al ratón con una máquina de anestesia para animales pequeños con isoflurano (3% en oxígeno). Verifique la profundidad de la anestesia usando el reflejo de retiro de la extremidad antes de continuar.
Decapitar al ratón con unas tijeras grandes e inmediatamente enfriar la cabeza en una solución de corte helada.
Abra el cráneo mediante una sola incisión en la línea media de caudal a rostral y empuje suavemente las piezas del cráneo hacia los lados con fórceps. Extirpa rápidamente el cerebro levantándolo suavemente fuera del cráneo con una espátula pequeña y redondeada. Corta el cerebelo con bisturí. Coloque el cerebro en una solución de corte helada.
Para la corteza prefrontal medial o los sitios de inyección de mPFC: corte la parte anterior del cerebro (que contiene mPFC) con un bisturí y colóquela en una solución de corte helada hasta el corte.
Retire el exceso de solución de corte con papel de filtro y pegue la parte posterior del cerebro en la etapa del vibrátomo.
Para las rebanadas de amígdala inclinadas, pegue el cerebro en un bloque de agar (4%) cortado en un ángulo de 35° (Figura 1D, centro). Para los cortes de la amígdala coronal, los sitios de inyección del núcleo geniculado medial/núcleo talámico intralaminar posterior (MGm/PIN) y los sitios de inyección de mPFC, pegue el cerebro directamente en la platina (Figura 1D, izquierda y derecha). Coloque un bloque de agar adicional detrás del cerebro para mayor estabilidad mientras corta.
Coloque la etapa en la cámara de corte con una solución de corte oxigenada helada que se mantenga a 4 °C utilizando una unidad de enfriamiento. Prepare cortes agudos de la amígdala (320 μm) con una hoja de zafiro. Coloque las rodajas en una cámara de interfaz suministrada con ACSF oxigenado a temperatura ambiente (RT).
Después de la preparación de cortes de amígdala aguda, coloque la cámara de interfaz en un baño de agua a 36 °C para recuperar cortes durante 35 a 45 min. A continuación, devuelva la cámara de interfaz a RT.
Durante el inicio de la etapa 1.10, corte cortes de los sitios de inyección como se describió anteriormente para cortes de amígdala aguda (pasos 1.8 - 1.9). Aquí no es necesario recuperar las lonchas en el baño de agua. opcional: Para estimar rápidamente la ubicación del lugar de inyección, observe los cortes en un estereoscopio equipado con una lámpara fluorescente y juegos de filtros adecuados.

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Resultados

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Figura 1: Inyecciones estereotácticas, preparación de cortes cerebrales agudos y visualización de fibras presinápticas.(A, B) Inyección estereotáctica de virus. A) Imagen de un ratón anestesiado colocado en un marco estereotáctico con el cráneo expuesto y la pipeta de inyección. Recuadro: Amplíe la imagen de la pipeta de inyección llena de solución de virus mezclada con verde rápido....