Generación de un corte coronal del cerebro que expone las regiones de la amígdala desde el cerebro de un ratón

En este artículo

Resumen

Fuente: Bosch, D., et al. Disección Optogenética Ex Vivo de Circuitos de Miedo en Cortes de Cerebro. J. Vis. Exp. (2016).

Este video muestra la preparación de finos cortes coronales del cerebro de un cerebro murino, exponiendo las regiones de la amígdala ricas en conexiones sinápticas de la corteza prefrontal medial. A continuación, los trozos se recuperan en líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado para mantener la viabilidad neuronal.

Protocolo

1. Preparación de Cortes Agudos

Prepare ACSF, solución de corte, herramientas (tijeras, bisturí, pinzas, espátula, pipeta Pasteur) y bloques de agar.
NOTA: Se requiere 1 L de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) por experimento. Como se publicó anteriormente, el ACSF se prepara disolviendo productos químicos en H2O bidestilado. La solución de corte se prepara suplementando 200 ml de ACSF con 0,87 ml de solución madre de 2 M MgSO₄.
Oxigenar ACSF y solución de corte durante todo el experimento con 95% de_O2 y 5% de_CO2.
Anestesiar profundamente al ratón con una máquina de anestesia para animales pequeños, utilizando isoflurano (oxígeno al 3%). Verifique la profundidad de la anestesia usando el reflejo de retirada de la extremidad antes de continuar.
Decapita al ratón con unas tijeras grandes e inmediatamente enfría la cabeza en una solución de corte helada.
Abra el cráneo mediante una sola incisión en la línea media desde la caudal hasta la rostra, y empuje suavemente las piezas del cráneo hacia los lados con fórceps. Retire rápidamente el cerebro levantándolo suavemente fuera del cráneo con una pequeña espátula redondeada. Corta el cerebelo con bisturí. Coloque el cerebro en una solución de corte helada.
En el caso de los sitios de inyección de mPFC, use un bisturí para cortar la parte anterior del cerebro (que contiene mPFC) y colóquela en una solución de corte helada hasta que se corte.
Retire el exceso de solución de corte con papel de filtro y pegue la parte posterior del cerebro en la etapa del vibráomo.
Para los cortes de la amígdala coronal, los sitios de inyección de MGm/PIN y los sitios de inyección de mPFC, pegue el cerebro directamente en la etapa (Figura 1D, izquierda y derecha). Coloque un bloque de agar adicional detrás del cerebro para darle estabilidad mientras corta.
Coloque la platina en una cámara de corte con una solución de corte oxigenada helada mantenida a 4 °C utilizando una unidad de refrigeración. Con una hoja de zafiro, prepare cortes coronales de la amígdala. Coloque las rodajas en una cámara de interfaz suministrada con ACSF oxigenado a RT.

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Resultados

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Figura 1. Inyecciones estereotácticas, preparación de cortes agudos de cerebro y visualización de fibras presinápticas. (A, B) Inyección estereotáctica de virus. A) Imagen de un ratón anestesiado colocado en un marco estereotáctico con el cráneo expuesto y la pipeta de inyección. Recuadro: Amplíe la imagen de la pipeta de inyección llena de solución viral mezclada con verde rápido. B...