Una técnica para aislar núcleos de células no neuronales en el giro dentado del hipocampo

Resumen

Fuente: Kerloch, T., et al. Clasificación negativa de núcleos activados por fluorescencia de neuronas combinadas con secuenciación de ARN de núcleos individuales para estudiar el nicho neurogénico del hipocampo. J. Vis. Exp. (2022).

El video muestra un método para aislar núcleos intactos de células gliales y madre en el giro dentado (DG) del hipocampo del ratón. El tejido DG se disocia mecánicamente en un tampón de homogeneización en frío para liberar los núcleos. Los restos de tejido y otros orgánulos liberados se descartan, y los núcleos se tiñen con una tinción de ADN y un anticuerpo conjugado con fluoróforos específico para el antígeno nuclear neuronal (NeuN). A continuación, se emplea la clasificación de núcleos activados por fluorescencia para aislar los núcleos NeuN negativos de las células no neuronales.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto

1. Disección del DG (Tiempo: 15 min)

1. Prepare los medios de aislamiento de núcleos 1 y 2 (NIM1 y NIM2), el tampón de homogeneización (HB) y los medios de lavado (WM) (Tabla 1). Coloque todos los tampones, medios, reactivos y herramientas en hielo hasta que los necesite. Coloque el homogeneizador Dounce (ver Tabla de Materiales) en hielo durante la preparación (mínimo 1 h antes de la etapa de homogeneización).
   nota: NIM1 puede prepararse y almacenarse a 4 °C durante un máximo de 6 meses. NIM2, HB y WM deben estar recién preparados.
   cautela: Manipule el ditiotreitol (DTT), el inhibidor de la proteasa y Triton X-100 con cuidado. Estos compuestos son irritantes de la piel y los ojos, extremadamente tóxicos y peligrosos para el medio ambiente acuático. Mientras usa estos productos químicos, use guantes protectores, ropa, protección para los ojos y la cara, lávese bien las manos después de manipularlos y evite liberarlos al medio ambiente.
2. Eutanasia a un ratón macho C57Bl/6J de 22 meses de edad por luxación cervical siguiendo el procedimiento del Programa 1 del Ministerio del Interior.
   nota: En este estudio, consulte la discusión sobre los fundamentos del uso de ratones de 22 meses. Sin embargo, este protocolo se puede realizar a cualquier edad a lo largo de la vida.
3. Diseccionar el cerebro de un ratón sacrificado y transferirlo a una placa de Petri de 10 cm llena de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x helada (Figura 1). Coloque la placa de Petri en hielo. Retira el cerebelo con un bisturí y corta el cerebro por la mitad entre ambos hemisferios (a lo largo del eje sagital).
4. Llene una nueva placa de Petri de 10 cm con PBS helado y colóquela sobre hielo. Transfiere la mitad del cerebro a la nueva placa de Petri. Con binoculares, diseccione el DG y repita este paso para obtener el segundo DG de la segunda mitad del cerebro.
   nota: Estos pasos (pasos 1.2-1.4) se adaptaron de un procedimiento descrito anteriormente. Es importante proceder lo más rápido posible en esta etapa para preservar la integridad de las células.
5. Transfiera los dos DG al homogeneizador Dounce preenfriado y agregue 1 mL de HB frío.

>2. Disociación de tejidos, aislamiento de núcleos individuales e inmunotinción anti-NeuN (Tiempo: 2 h)

1. Homogeneizar el tejido con 10 golpes del mortero "A" suelto, seguidos de 15 golpes del mortero "B" apretado.
   nota: La homogeneización del monzal debe realizarse con el mortero sobre hielo con movimientos suaves para reducir el calor causado por la fricción y la formación de espuma. Todos los tampones y el equipo deben enfriarse previamente y mantenerse en hielo durante el procedimiento.
2. Transfiera el homogeneizado a un tubo preenfriado de 15 mL; enjuague el homogeneizador Dounce con 1 mL de HB frío y combine con el mismo tubo. Añadir 3 mL de HB al tubo de 15 mL e incubar 5 min en hielo. Mezcle 2 veces invirtiendo el tubo suavemente.
3. Humedecer previamente un tapón de colador de 70 μm con 0,5 mL de HB sobre un tubo de ensayo de 50 mL. Cuele la suspensión de núcleos del paso 2.2 volcando suavemente el tubo de 15 ml en el filtro de células. Lave el colador de células con 0,5 mL de HB.
4. Retire el filtro de células y centrifugue el tubo de ensayo a 500 x g durante 5 min a 4 °C, utilizando una centrífuga de cubo oscilante. Deseche el sobrenadante.
   nota: El colado del homogeneizado ayudará a reducir los residuos, lo cual es fundamental para la citometría de flujo y los pasos posteriores de secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq).
5. Vuelva a suspender el pellet suavemente en 4 mL de HB con una pipeta P1000. Incubar en hielo durante 5 min. Centrifugar a 500 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3 mL de WM.
6. Humedecer previamente un tapón de 35 μm sobre un tubo de ensayo de 15 mL con 0,5 mL de WM. Filtrar la suspensión de núcleos desde el paso 2.5 a través del filtro de células, pipeteando suavemente 0,5 mL a la vez con una pipeta P1000.
7. Lave la tapa del colador con 0,5 mL de WM y coloque el tubo en hielo. Transfiera el filtrado a un nuevo tubo de 15 ml y centrifugue durante 5 min y 4 °C a 500 x g. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3 mL de WM.
8. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de WM con el antígeno nuclear antineuronal de ratón (NeuN), el anticuerpo conjugado AlexaFluor 488 (anti-NeuN-AF488, 1:32.000) y 1 μg/mL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Incubar durante 45 min en hielo en la oscuridad.
   nota: Para optimizar la inmunotinción de los núcleos aislados, se recomienda valorar el anticuerpo para determinar la dilución óptima para el análisis y la clasificación de la citometría de flujo. A continuación, realice controles adecuados para confirmar que las condiciones de tinción son óptimas. Por ejemplo, con el anticuerpo anti-NeuN-AF488 conjugado, se realizó un control negativo (es decir, sin adición del anticuerpo, Figura 2A) y un control positivo (es decir, tinción con el anticuerpo, Figura 2B) para evaluar la segregación de poblaciones no teñidas y teñidas. Cuando se comienza a trabajar con un anticuerpo conjugado con AF488, se recomienda realizar un control de isotipo conjugado con AF488 para evaluar la especificidad. Si se utiliza un anticuerpo no conjugado, puede ser necesario un control adicional, como la adición de un anticuerpo secundario solo a una preparación de núcleos, para evaluar la unión inespecífica del anticuerpo secundario.

>3. Clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FANS) para excluir poblaciones neuronales (Tiempo: 45 min)

1. Transfiera la suspensión de núcleos inmunoteñidos a un tubo de ensayo de 5 mL y manténgalo en hielo hasta el inicio del procedimiento de citometría de flujo.
   nota: Si se trabaja con trozos de tejido más grandes que dos DG de ratón, es posible que se requiera una dilución adicional con tampón WM para evitar la obstrucción del clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) si la densidad de núcleos en la solución se vuelve alta.
2. Agite las muestras durante 3 s a baja velocidad antes de colocar los tubos en el instrumento FACS (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: (Configuración FACS) Las máquinas clasificadoras deben alinearse al comienzo del procedimiento con las partículas de calibración siguiendo las recomendaciones del fabricante. El retardo de caída se calibró con perlas o microesferas (ver Tabla de Materiales) según el modelo FACS. Las muestras se clasificaron a 4 °C en modo de pureza. Para reducir el volumen de recolección, los núcleos se clasificaron a través de una boquilla de 70 μm a la presión recomendada para el citómetro de flujo. Los núcleos se clasificaron en tubos de baja unión de 1,5 mL (ver Tabla de Materiales) que contenían 50 μL de WM. Todos los tubos de recolección se recubrieron con PBS + 5% de albúmina sérica bovina (BSA) a 4 °C durante la noche para reducir el riesgo de que los núcleos se adhirieran a las paredes del tubo.
3. Para adquirir los datos de una muestra de la suspensión de núcleos teñidos, configure las puertas en la altura de DAPI y el área de DAPI para excluir los restos celulares y los núcleos agregados (Figura 3A). Además, separe los núcleos individuales de los agregados o desechos celulares teñidos con DAPI restantes configurando las puertas en el área de dispersión del lado logarítmico (SSC) y el área de dispersión logarítmica hacia adelante (FSC) (Figura 3B).
4. Configure las compuertas para el anti-NeuN-AF488 y el área FSC, para aislar la población negativa de NeuN-AF488, como se muestra en la Figura 3C.
5. Después del análisis, utilizando la estrategia de compuerta descrita anteriormente, clasifique la población negativa de NeuN-AF488 en un tubo de recolección de 1,5 mL lleno de 50 μL de WM.
   nota: Siguiendo la estrategia de compuerta descrita anteriormente y el procedimiento de disección para aislar el DG del cerebro de un ratón adulto, se espera que la población negativa de NeuN-AF488 represente ~ 14% de los núcleos individuales.

Tabla 1: Composiciones de medios y tampones utilizados en el estudio.

Medio de aislamiento de núcleos #1 (NIM1) – almacenar hasta 6 meses a 4 °C
componente	Volumen (μL)	Concentración final (mM)
1,5 m de sacarosa	1.833,30	250
1 M KCl	Artículo 275	25
1 M MgCl2	55	5
1 M Tampón Tris, pH 8.0	110	10
Agua libre de nucleasas	8.726,70	-
Volumen total	11.000	-
Medio de aislamiento de núcleos #2 (NIM2) – hacer fresco
componente	Volumen (μL)	Concentración final
NIM1	10.769	-
TDT de 1 mM	11	1 μM
100x Inhibidor de la proteasa	110	1 vez
Tritón X-100 10% (v/v)	110	0.1% (v/v)
Volumen total	11.000	-
Tampón de homogeneización (HB) – hacer fresco
componente	Volumen (μL)	Concentración final
NIM2	10.958,75	-
Inhibidor de ARNasa, 40 U μL-1	27.5	100 U mL-1
RNasina, 40 U μL-1	13.75	50 U mL-1
Volumen total	11.000	-
Medios de lavado (WM)
componente	Volumen (μL)	Concentración final
BSA 7.5%	1.466,70	1%
Inhibidor de ARNasa, 40 U μL-1	27.5	100 U mL-1
RNasina, 40 U μL-1	13.75	50 U mL-1
Pbs	9.492,05	-
Volumen total	11.000	-

Resultados

Figura 1: Preparación de una suspensión de un solo núcleo a partir de la DG disecada de ratones adultos para la secuenciación de snRNA de poblaciones no neuronales. Diagrama de flujo que describe los pasos principales del protocolo que incluyen la disección de DG de ratón, la preparación de una suspensión de núcleos individuales, la inmunotinción de NeuN y la clasificación negativa de NeuN-FANS antes...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microtubo de 0,5 ml	Eppendorf	30124537
10.00μm Flouresbrite YG Microesferas de carboxilato	Policiencias	15700-10
Tubos de centrífuga de polipropileno de 15 mL	Corning	430052
2 pares de pinzas estériles Dumont #5	Herramientas de Bellas Ciencias	11252-30
4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Sigma Aldrich	D9564-10MG
Sistema TapeStation 4150	Agilent	N/A
Tubo de ensayo de polipropileno de alta claridad de 5 mL de fondo redondo con tapón a presión	halcón	352063
Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL con tapón a presión de filtro de celdas	halcón	352235
Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mL	Corning	430829
Filtro de células de 70 μm	halcón	352350
8 Partículas de calibración SPHERO Rainbow de 8 picos	BD Biociencias	RCP-30-5A
Cuentas de Accudrop	BD Biociencias	N/A
Centrífuga Allegra X-30R	Beckman Coulter	N/A
Anticuerpo anti-NeuN, clon A60, Alexa Fluor 488 conjugado	Millipore	MAB377X
BD FACSAria Citómetro de flujo de fusión	BD Biociencias	N/A
Beckman Coulter MoFlo XDP	Beckman Coulter	N/A
BSA 7.5%	Gibco	15260037
Ditiotreitol (TDT)	Termo Científico	R0861
Juego de molinillo de pañuelos de onza: mortero, mortero suelto (A) y mortero apretado (B)	Kimble	D8938-1SET
Eppendorf Tubos Proteína LoBind 1.5ml	Eppendorf	30108116
Stop, 100x Inhibidor de la proteasa	ThermoFisher	78429
Kcl	Cualquier proveedor de productos químicos		Hecho en laboratorio
LUNA-FX7 Contador de celdas automatizado	Logotipos Biosystems	N/A
MgCl2	Cualquier proveedor de productos químicos		Hecho en laboratorio
N°10 bisturíes estériles desechables guardados	Swann-Morton	6601
Agua libre de nucleasas	Sigma Aldrich	W4502-1L
Par de tijeras quirúrgicas estériles para estudiantes	Herramientas de Bellas Ciencias	91401-12
Pbs	Cualquier proveedor de productos químicos		Hecho en laboratorio
Inhibidor de ARNasa 40 U μl-1	Ambiente	AM2684
RNasina 40 U μl-1	Promega	N211A
Placa de Petri estéril	Corning	430167
sacarosa	Sigma Aldrich	59378-500G
Tampón Tris, pH 8.0	Cualquier proveedor de productos químicos		Hecho en laboratorio
Tritón X-100 10% (v/v)	Sigma Aldrich	T8787-250ML
Azul de tripano	Invitrogen	T10282