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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Materiales
- Prepare las siguientes soluciones antes de comenzar el protocolo:
- Prepare el tampón de carga añadiendo suero fetal bovino (FBS, 2%) a solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Agregue tinte rojo neutro (NR) (1% final) al PBS.
- Prepare las siguientes soluciones utilizando el Kit de Disociación Cerebral para Adultos disponible en el mercado (consulte la Tabla de Materiales).
- Para preparar la mezcla de enzimas 1, pipetee 1,9 ml de tampón Z y 50 μl de enzima P en un tubo de centrífuga de 15 ml.
- Para preparar la mezcla de enzimas 2, pipetee 20 μL de tampón Y y 10 μL de enzima A en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Prepare la solución de remoción de escombros.
>2. Perfusión y disección de ratones
- Por vía intraperitoneal (i.p.) inyectar al ratón 500 μL de colorante NR al 1% en PBS 2-3 h antes de la anestesia.
nota: La inyección intraperitoneal de NR en modelos de ratón desmielinizantes ayuda a discernir las lesiones (Figura 1).
- Anestesiar al ratón con pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) y asegurarse de que el ratón esté anestesiado con éxito examinando las respuestas al dolor.
- Abra la cavidad torácica del ratón y exponga el corazón.
- Cortar con cuidado una pequeña esquina de la aurícula derecha y perfundir intracárdicamente el ratón con 20-30 mL de PBS frío del ventrículo izquierdo.
- Decapita al ratón bajo anestesia.
- Abre el cráneo del ratón y libera con cuidado el cerebro del cráneo.
- Transfiera el cerebro al molde de rodajas de cerebro de ratón y corte el cerebro en rodajas de 0,1 cm.
- Retire las rodajas de cerebro y colóquelas en PBS frío en una placa de Petri (60/15 mm). Con pinzas microquirúrgicas, microdiseccione las lesiones marcadas con tinte NR alrededor del cuerpo calloso bajo un microscopio estereoscópico.
nota: Asegurarse de que el tejido diseccionado esté lo más completo posible para facilitar la transferencia posterior; El progreso total de la disección debe completarse en 2 h.
- Transfiera el tejido diseccionado a tubos de centrífuga de 15 mL que contengan la cantidad adecuada de tampón de carga fría.
nota: Agrupe el tejido del cuerpo calloso de 2-3 ratones juntos en un tubo como una muestra.
>3. Disociación de tejidos
- Centrifugar el tejido diseccionado a 300 ×g durante 30 s (después de alcanzar esta velocidad) para recoger la muestra en el fondo del tubo.
- Precalentar la mezcla de enzimas 1 y 2 a 37 °C en una incubadora.
- Añadir 1.950 μL de mezcla de enzimas precalentada 1 a una muestra y digerir en una incubadora a 37 °C durante 5 min.
- Agregue 30 μL de mezcla de enzimas precalentada 2 y mezcle suavemente.
- Digirir en una incubadora a 37 °C durante 15 min y mezclar suavemente cada 5 min.
- Agregue 4 ml de PBS frío al tubo después de la digestión y agite suavemente.
- Coloque filtros de 70 μm en tubos de centrífuga de 50 ml y humedezca previamente los filtros con 500 μL de PBS frío. Filtre el tejido disociado pasando las muestras de tejido digerido a través de los filtros y transfiera la suspensión filtrada en el tubo de centrífuga de 50 mL a un tubo de centrífuga de 15 mL.
nota: Omita este paso si la cantidad de tejido es demasiado pequeña.
- Centrifugar las muestras de tejido filtradas a 300 ×g durante 10 min a 4 °C y aspirar el sobrenadante lenta y completamente.
nota: Todos los pasos deben realizarse en hielo, excepto la digestión enzimática.
>4. Remoción de escombros
- Vuelva a suspender el pellet celular suavemente con 1.550 μL de PBS frío.
- Agregue 450 μL de solución fría para la eliminación de residuos y mezcle bien.
- Superponga la mezcla anterior lenta y suavemente con 2 x 1 mL de PBS frío con una pipeta de 1.000 μL.
nota: Incline el tubo de centrífuga 45 ° y agregue lentamente PBS a lo largo de la pared del tubo con la pipeta.
- Transfiera el tubo lenta y suavemente a una centrífuga y centrifuga a 4 °C y 3.000 × g durante 10 minutos.
- Busque tres capas después de la centrifugación. Aspire completamente las dos capas superiores con una pipeta de 1.000 μL (Figura 2).
- Llene el tubo hasta 5 ml con tampón de carga fría e invierta suavemente el tubo tres veces.
- Centrifugar a 4 °C y 1.000 × g durante 10 min. Aspirar completamente el sobrenadante y evitar alterar el pellet de la célula.
>5. Separación magnética de células microgliales
- Vuelva a suspender el pellet celular con 90 μL de tampón de carga y agregue 10 μL de perlas CD11b (Microglia).
- Mezclar bien e incubar durante 15 min a 4 °C.
- Agregue 1 mL de tampón de carga y pipetee suavemente el líquido hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1.000 μL para lavar las células después de la incubación. Centrifugar las células a 4 °C y 300 × g durante 10 min y aspirar completamente el sobrenadante para eliminar las perlas sueltas.
- Vuelva a suspender las células en 500 μL de tampón de carga.
- Coloque la columna MS con su separador para la selección positiva en el campo magnético.
- Enjuague la columna con 500 μL de tampón de carga para proteger las celdas y garantizar la eficiencia de la clasificación magnética, siguiendo el protocolo del fabricante.
- Aplique la suspensión de celdas en la columna MS y deseche el flujo que contiene celdas sin etiquetar.
- Agregue 500 μL de tampón de carga a la columna tres veces para lavar las celdas que se adhieren a la pared de la columna y desechar el flujo.
nota: Solo agregue un nuevo tampón de carga para el lavado cuando el depósito de la columna esté vacío.
- Retire la columna del separador después de lavar la columna y colóquela en un tubo de centrífuga de 15 mL.
- Agregue 1 mL de tampón de carga en la columna y empuje el émbolo hacia el fondo para enjuagar las celdas marcadas magnéticamente. Repita este paso tres veces para recoger completamente las células marcadas magnéticamente.
