Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de la solución
- Placas NGM-Agar (1 L)
- Agregue 3 g de NaCl, 2,5 g de medio de peptona (por ejemplo, Bacto-Peptona) y 20 g de agar. Después de la esterilización en autoclave, agregue 1 mL de colesterol (5 mg/mL en caldo de etanol [EtOH] al 95%), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 25 mL de 1 M K2PO4 y 1 mL de anfotericina B (2,5 mg/mL de stock).
- Placas de ARNi NGM-Agar (1 L)
- Agregue 3 g de NaCl, 2,5 g de medio de peptona y 20 g de agar. Después de la esterilización en autoclave, agregue 1 mL de colesterol (5 mg/mL en stock de EtOH al 95%), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 25 mL de 1 M K2PO4, 1 mL de anfotericina B (2,5 mg/mL de stock), 1 mL de 1 M de isopropil β- d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y 1 mL de carbenicilina (50 mg/mL).
- Luria-Bertani (LB)-Agar (1 L)
- Añadir 10 g de medio de peptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 20 g de agar, 10 mL de 1 M Tris pH 8.0. Añadir H2O a 1 L. Después de esterilizar en autoclave, agregue 1 mL de 50 mg/mL de carbenicilina y 2,5 mL de 5 mg/mL de tetraciclina.
- LB Medio (1 L)
- Añadir 10 g de medio de peptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl y 10 mL de 1 M Tris pH 8.0. Añadir H2O a 1 L. Después de esterilizar en autoclave, agregue 1 mL de 50 mg/mL de carbenicilina.
- Tampón M9 (1 L)
- Añadir 6,0 g de Na2HPO4, 3 g de K2PO4, 5 g de NaCl y 50 mg de gelatina. Antes de usar, agregue 1 mL de 1 M MgSO4.
- Solución blanqueadora (10 mL)
- Añadir 1 mL de NaClO y 2 mL de NaOH 5 N. Añadir H2O a 10 mL.
>2. Preparación de placas de ARNi
>Nota: C. elegans se cultiva típicamente en el laboratorio en placas de Petri de 6 cm que contienen 7,5 mL de agar medio de crecimiento de nematodos (NGM-Agar). Este protocolo está optimizado para gusanos mantenidos a 15 °C. Para preparar placas con NGM, utilice técnicas estériles estándar para evitar la contaminación por hongos y bacterias. A continuación se muestra el protocolo para preparar placas de NGM suplementadas con reactivos para ARNi.
- Prepare placas de ARNi NGM-Agar de 6 cm que contengan 1 mM de IPTG y 50 μg/mL de carbenicilina. Déjalos secar durante 24 – 48 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Mantenga las placas de ARNi a 4 °C en la oscuridad. No lo use si tiene más de 14 días.
- Seleccione el clon de la bacteria ARNi (Escherichia coli HT115) que contiene el plásmido L4440 con la secuencia de ADN del gen lin-53 del stock de glicerol congelado de la biblioteca de ARNi disponible13 en placas LB-agar que contienen 50 μg/mL de carbenicilina y 12,5 μg/mL de tetraciclina utilizando el patrón de estrías trifásico. Cultive las bacterias a 37 °C durante la noche. Este clon permite la producción dependiente de IPTG de lin-53 dsRNA en las bacterias.
- Además, cultive bacterias de ARNi que contengan el plásmido L4440 sin ninguna secuencia génica como control de vector vacío.
- Al día siguiente, elija una sola colonia de placas de agar LB de lin-53 o vector vacío con una punta de pipeta de 200 μL e inocule cada una de ellas en un tubo de cultivo separado que contenga 2 mL de medio LB líquido suplementado con 50 μg/mL de carbenicilina. Cultive los cultivos durante la noche a 37 °C hasta que alcancen una densidad óptica (OD) a 600 nm de 0,6 – 0,8. Mida el diámetro exterior con un espectrofotómetro.
PRECAUCIÓN: El medio LB líquido no debe contener tetraciclina en contraste con la placa de agar LB utilizada para rayar las bacterias del stock de glicerol, ya que la inclusión de tetraciclina durante la alimentación conduce a una disminución de la eficiencia del ARNi.
- Añadir 500 μL de cada cultivo bacteriano (lin-53 o vector vacío) a placas de ARNi NGM-Agar de 6 cm utilizando una multipipeta. Incube las placas con una tapa cerrada durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad para que se sequen. Durante este tiempo, el IPTG en las placas NGM inducirá la producción de dsRNA en las bacterias.
- Utilice al menos 3 placas por cultivo bacteriano por experimento. Esto proporcionará 3 réplicas técnicas para cada experimento.
- Almacene las placas de ARNi de agar NGM secas con bacterias a 4 °C en la oscuridad durante un máximo de dos semanas.
>3. Preparación de la cepa BAT28 de C. elegans
- Mantener la cepa de gusano BAT288 que contiene los transgenes otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] y ntIs1 [gcy-5prom::gfp] en bacterias OP50 utilizando placas estándar de NGM-Agar a 15 °C.
Nota: Para obtener un protocolo detallado sobre el cultivo de nematodos, consulte. El rol-6(su1006) es un alelo dominante y un marcador fenotípico de inyección comúnmente utilizado16 que causa el movimiento de balanceo típico. Se utiliza en el transgén otIs305 para rastrear hsp-16.2prom::che-1.
- Mantenga la cepa BAT28 a 15 °C en todo momento para evitar la activación precautoria del transgén hsp-16.2prom::che-1. Reduzca la exposición a temperaturas superiores a 15 °C mientras manipula la deformación tanto como sea posible.
- Para sincronizar la edad de los gusanos, use la técnica de blanqueo.
- Lave las placas de agar NGM de 6 cm que contengan adultos y huevos de BAT28 con tampón M9 de 900 μL. Enseres en pellets por centrifugación a 900 x g durante 1 min. Retire el sobrenadante.
- Agregue de 0,5 a 1 ml de solución blanqueadora y agite el tubo durante aproximadamente 1 minuto hasta que los gusanos adultos comiencen a abrirse. Monitor con un microscopio estereoscópico estándar.
- Pellets de gusanos centrifugando a 900 x g durante 1 min. Retirar el sobrenadante.
- Lave el gránulo de gusano 3 veces añadiendo 800 μL de tampón M9 y centrifugando a 900 x g.
- Coloque los huevos limpios en placas NGM frescas sembradas con la bacteria OP50. Cultive una población blanqueada en bacterias OP50 a 15 °C hasta que alcancen la etapa L4 (aproximadamente 4 días). Las larvas L4 pueden reconocerse por una mancha blanca aproximadamente a mitad de camino a lo largo del lado ventral del gusano18 utilizando un microscopio estereoscópico estándar.
nota: Para lograr el fenotipo de conversión de células germinales a neuronas tras el agotamiento de lin-53, es necesario que se agote en la generación parental (P0). La puntuación para el fenotipo de conversión se lleva a cabo en la siguiente generación (generación filial F1). Para lograr la depleción de lin-53 que ya está en el P0, los animales L4 se someten a ARNi.
- Transfiera manualmente 50 gusanos de etapa L4 por réplica utilizando un alambre de platino a una placa NGM que no contenga ninguna bacteria y permita que los gusanos se alejen de cualquier bacteria OP50 transferida. Deje que los gusanos se muevan en el plato durante unos 5 minutos. Utilice las bacterias de las placas de ARNi NGM-Agar previamente sembradas con bacterias de ARNi lin-53 (o control de vector vacío) para transferirlas a las placas de ARNi respectivas.
- Evite transferir las bacterias OP50 a las placas de ARNi reales. Trabaje rápido para minimizar el tiempo de exposición de la deformación a temperaturas superiores a 15 °C.
- Incubar los gusanos en placas de ARNi de agar NGM a 15 °C durante aproximadamente 7 días hasta que la progenie F1 de los gusanos alcance la etapa L3 – L4. Se pueden separar claramente de los animales P0 ya que son más grandes y gruesos que la progenie F1.
- Comprobar visualmente con un microscopio estereoscópico estándar si los gusanos de progenie F1 muestran el fenotipo de vulva protuberante (pvul) como se muestra en la Figura 1. El ARNi contra lin-53 tiene efectos pleiotrópicos y causa el fenotipo pvul que se puede utilizar para evaluar si el ARNi contra lin-53 ha tenido éxito.
nota: El ARNi contra lin-53 también puede causar letalidad de los embriones F1. Este efecto aumenta si las placas se exponen a grados superiores a 15 °C antes de que los animales alcancen la etapa L3 – L4. Los embriones muertos pueden reconocerse por la detención del desarrollo y la falta de eclosión.
- Incube las placas en la oscuridad, ya que el IPTG es sensible a la luz.
>4. Inducción de la reprogramación de células germinales
- Incubar placas de ARNi examinadas que contienen lin-53 y progenie F1 tratada con ARNi vector vacío durante 30 min a 37 °C en la oscuridad para activar CHE-1. Utilice una incubadora ventilada, ya que permite un choque térmico más eficiente.
- Deje que los animales sometidos a choques térmicos se recuperen durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y luego incube las placas a 25 °C durante la noche en la oscuridad.
- Utilizando un microscopio estereoscópico estándar acoplado a una fuente de luz de fluorescencia, examine a los animales bajo el filtro de proteína fluorescente verde (GFP) en busca de señales derivadas de gcy-5prom::gfp en el área media del cuerpo de los gusanos, como se muestra en la Figura 2. Ajuste del microscopio para señales GFP: excitación máxima a 488 nm con emisión máxima a 509 nm.
- Evalúe el grado de conversión de células germinales en neuronas mediante el montaje de animales con señales de GFP en el área media del cuerpo en portaobjetos de microscopía que contienen almohadillas de agar.
- Cuente el número de animales que muestran la conversión de células germinales a neuronas en comparación con los animales oscuros para evaluar la penetrancia del fenotipo. Típicamente, alrededor del 30% de los animales muestran señales discretas de GFP en la línea germinal tras el agotamiento de lin-53, mientras que no más del 5% de los animales muestran señales difusas de GFP en la línea germinal tras el ARNi vectorial vacío.
