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Descargo de responsabilidad: Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Homogeneización mecánica del cerebro y la médula espinal
>NOTA: Los volúmenes descritos en esta sección son suficientes para la homogeneización de la mitad del cerebro o la médula espinal.
- Enfriar previamente el mortero de vidrio de la trituradora de tejidos Dounce (Tabla de Materiales) colocado en hielo.
- Agregue 3 mL de solución salina balanceada de Hank (HBSS) preenfriada al mortero.
- Transfiera el tejido (cerebro o médula espinal) del pocillo de la placa de 6 pocillos al mortero de vidrio, asegurándose de que esté sumergido en 1x HBSS y se asiente en el fondo del mortero.
- Triture suavemente el pañuelo con 10 golpes de mortero A seguidos de 10 golpes de mortero B. Transfiera la mezcla homogeneizada a un nuevo tubo cónico de 15 mL.
- Llene el tubo hasta un volumen final de 10 mL utilizando 1x HBSS preenfriado y centrifugar durante 10 min a 320 x g a 4 °C.
- Aspirar el sobrenadante y añadir 1x HBSS helado a cada tubo hasta un volumen final de 7 mL y resuspender suavemente el pellet por vórtice.
>2. Remoción de escombros
NOTA: La eliminación de residuos, compuestos principalmente de tejido no digerido y vainas de mielina, es un paso crítico para permitir una tinción eficiente del homogeneizado de tejido para los análisis citométricos de flujo posteriores.
- Filtre cada muestra a través de un colador de células de 70 μm para eliminar los trozos de tejido no digeridos. Este paso es particularmente importante cuando se trabaja con tejidos de la médula espinal, ya que es más probable que estas muestras contengan fragmentos de nervios no digeridos o meninges que podrían afectar los pasos posteriores.
- Asegúrese de que el volumen final sea de 7 ml en cada tubo de muestra. De lo contrario, llene con 1x HBSS helado hasta 7 mL.
- Agregue 3 mL de solución isotónica de Percoll (IPS) preenfriada a cada muestra para obtener un volumen final de 10 mL de una solución que contenga medio de gradiente de densidad a una concentración final del 30%. Agite suavemente las muestras para asegurarse de que se mezclan homogéneamente.
- Centrifugar muestras durante 15 min a 700 x g a 18 °C, asegurándose de ajustar la aceleración de la centrífuga a 7 y el freno a 0,
nota: La centrifugación debe durar aproximadamente 30 minutos.
- Retire delicadamente las muestras de la centrífuga.
nota: Un disco blanquecino compuesto de desechos y mielina debe ser visible flotando en la superficie de la solución. Un gránulo (que contiene las células de interés) debe ser visible en la parte inferior del tubo.
- Aspire con cuidado todo el disco blanquecino de residuos y luego el resto del sobrenadante, asegurándose de no desalojar el pellet. Deje unos 100 μL de solución en la parte superior del pellet de la celda para evitar el riesgo de desprenderlo inadvertidamente.
- Añada 1 mL de solución de bloqueo (BL) de citometría de flujo (FACS), vuelva a suspender el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 1000 μL y transfiera las muestras a tubos de 1,5 mL.
- Centrifugar durante 5 min a 450 x g a temperatura ambiente (RT).
- Aspirar suavemente el sobrenadante y volver a suspender el pellet en el tampón adecuado compatible con los análisis posteriores