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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de los materiales
- Tampón de clasificación celular activado magnéticamente (MACS): Prepare 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5% (Tabla de Materiales) en PBS-/-.
- Solución madre de colagenasa IV (20 U/μL): Vuelva a suspender el polvo en PBS+/+ (Tabla de Materiales), alícuota, y almacene a -20 °C.
nota: La colagenasa IV requiere MgCl2 para estar completamente activa; no congele ni descongele la solución de colagenasa IV.
- Solución anestésico-analgésica: Mezclar 150 μL de ketamina (150 mg/kg), 25 μl de xilacina (5 mg/kg) y 330 μl de buprecare (0,1 mg/kg) en 1 mL de PBS-/-.
nota: Prepare la solución anestésico-analgésica de manera extemporánea y no la conserve más de un día.
- Solución de heparina (100 U/mL): Vuelva a suspender el polvo en PBS-/-.
- Prepare el sistema de inserción de infusión conectando un tubo a un decantador Erlenmeyer lleno de PBS-/-. Conecte una aguja de 23 G a la extremidad del tubo de infusión. Abra el inserto de infusión y deje correr el PBS hasta que no haya burbujas en el tubo.
- Prepare la lupa binocular equipada con una luz.
>2. Carcasa de ratones C57BL/6
- Para el análisis de las células T o mieloides CP (plexos coroideos), se utilizan cuatro ratones para cada uno y se agrupan las cuatro CP (dos de cada ventrículo lateral, el tercer ventrículo y el cuarto ventrículo CP; para ocho ratones en total). La no agrupación de PC conlleva el riesgo de no detectar las raras poblaciones inmunitarias en PC debido a su baja abundancia.
- Deje que los ratones se aclimaten durante al menos 7 días antes de cualquier experimentación. Mantener a los ratones en condiciones libres de patógenos a temperatura y humedad constantes, en un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h o 14/10 h, con agua y alimento en pellets estándar ad libitum.
>3. Perfusión PBS y disección cerebral
- Pesar cada ratón e inyectar 10 μL/g de la solución de mezcla anestésico-analgésico (paso 1.3) por vía intraperitoneal.
- Espere alrededor de 30 minutos para obtener una analgesia eficaz (verifique la profundidad de la anestesia pellizcando los dedos del mouse).
- Coloque al ratón anestesiado boca arriba sobre el soporte de disección y pegue sus palmas al soporte de disección.
- Pellizcando la piel del animal con pinzas y con unas tijeras, abra el abdomen, el diafragma y el tórax para exponer el corazón><.
nota: Cuando se abre el tórax, el cerebro se vuelve anóxico. Uno debe proceder con precisión y rapidez a través de los siguientes pasos de la perfusión.
- Inyecte 20 μL de solución de heparina 100 U/mL directamente en el ventrículo izquierdo.
- Con unas tijeras finas, haga una incisión de al menos 3 mm en la aurícula derecha para permitir que la sangre fluya fuera del cuerpo.
- Inmediatamente después, inserte la aguja de 23 G colocada en el extremo del tubo de infusión a través de la punta del ventrículo izquierdo.
- Abra el sistema de infusión al máximo y espere la perfusión completa: Con una aguja de 23 G a un caudal de aproximadamente 6 mL/min, la perfusión se completa en 3 min.
nota: La decoloración uniforme de órganos como el hígado atestigua la eficacia de la perfusión.
- Cierre el sistema de infusión y retire la aguja del ventrículo cardíaco.
- Retire la cinta de las palmas del mouse. Coloque el ratón en posición ventral.
- Pellizcando la piel del animal con pinzas y con unas tijeras, retire la piel de la parte superior de la cabeza, desde los ojos hasta las orejas.
- Con la ayuda de unas tijeras, corte el cráneo primero entre los ojos y luego lateralmente desde cada ojo hasta la médula espinal justo por encima de los músculos maseteros. Para ello, utilice la extremidad de las tijeras y proceda suavemente para evitar dañar el cerebro con las tijeras.
- Abra el cráneo con fórceps pellizcándolo desde la extremidad entre los ojos.
- Use tijeras para cortar la médula espinal y extraer el cerebro con fórceps, colocando sus dos puntos en el lado lateral del cerebro para inclinarlo y colocarlo en una placa de Petri llena de PBS+/+ helado. A continuación, se recogen inmediatamente las CP.
nota: Compruebe si hay decoloración del cerebro para verificar la eficacia de la perfusión.
>4. Disección del plexo coroideo del cerebro
- Coloque el cerebro con el lado dorsal hacia arriba en la placa de Petri y debajo de los objetivos de las lupas binoculares.
- Con la ayuda de pinzas para mantener el cerebro en su lugar, inserte los dos extremos de otra pinza a través de la línea media entre los hemisferios.
- Use las pinzas para separar la corteza con el calloso y el hipocampo del tabique, exponiendo el ventrículo lateral y una parte del tercer ventrículo.
- Identifique la PC lateral como un velo largo que recubre el ventrículo lateral y que se ensancha en ambos extremos. Utilice los dos extremos de una pinza delgada para atrapar el PC lateral. Tenga cuidado de recoger la parte posterior triangular que puede estar oculta por el pliegue posterior del hipocampo.
- Separar la corteza, el cuerpo calloso y el hipocampo del hemisferio contralateral del tabique para exponer todo el tercer ventrículo y el ventrículo lateral opuesto.
- Recoja el tercer PC con pinzas finas, que se puede identificar como una estructura corta con un aspecto superficial granular.
- Recoge el otro PC lateral.
- Inserte los dos extremos de una pinza entre el cerebelo y el mesencéfalo. Separe el cerebelo de la protuberancia y la médula para exponer el cuarto ventrículo.
- Identifique el cuarto CP como una estructura globular larga con un aspecto superficial granular que recubre el cuarto ventrículo desde el extremo lateral derecho hasta el extremo izquierdo entre el cerebelo y la médula. Recoja el cuarto PC con pinzas finas.
nota: El recubrimiento a base de silano de las pinzas puede prevenir la pegajosidad de la PC en las pinzas.
- Repita los pasos 3.1-4.9 para cada uno de los otros siete ratones. Mientras tanto, la PC recolectada se puede mantener temporalmente en un tubo colocado sobre hielo.
>5. Preparación de muestras para el análisis de citometría de flujo
- Llene el tubo que contiene toda la CP disecada hasta 750 μL de PBS+/+.
nota: La deposición de CP disecado con pinzas finas en el tubo produce un pequeño volumen de PBS+/+. Para evitar una posible pérdida de tejido CP, es mejor completar el volumen existente a 750 μL que eliminarlo y reemplazarlo con 750 μL frescos de PBS+/+.
- Añadir 15 μL de solución madre de colagenasa IV de 20 U/μL (ver paso 1.2) para una concentración final de 400 U/mL.
nota: La ADNasa I (150 μg/mL) puede prevenir la aglomeración excesiva de células.
- Incubar CP con colagenasa IV a 37 °C bajo agitación suave (300 RPM) durante 45 min.
- Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo unas 10 veces para finalizar la disociación de CP.
- Llene el tubo CP hasta 1,5 mL con tampón MACS (consulte el paso 1.1 de la receta) para detener la actividad de la colagenasa IV.
nota: La actividad de la colagenasa IV se detiene a bajas temperaturas y es inhibida por la albúmina sérica.
- Centrifugar las células a 500 x g, durante 5 min, a 4 °C. Deseche el sobrenadante y lavar las células con 1,5 mL de tampón MACS.
- Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min, a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 220 μL de tampón MACS.