Obtención de un cultivo de células gliales mixtas a partir de un cerebro de ratón neonatal

Resumen

Fuente: Sarkar, S. et al., Aislamiento magnético rápido y refinado de CD11b de microglía primaria con pureza y versatilidad mejoradas. J. Vis. Exp. (2017)

El video demostró el método de aislar y cultivar células del cerebro de un ratón neonatal. Implicó la disociación enzimática y mecánica del cerebro, seguida de cultivo en medios de crecimiento carentes de factor de crecimiento neuronal para obtener una población glial mixta.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Cultivo de cultivos gliales mixtos

1. Decapita rápidamente a los cachorros de 1 a 2 días de edad con unas tijeras de 5,5 pulgadas y coloca las cabezas inmediatamente en un tubo de 50 ml sobre hielo. Nótese que esta decapitación es el modo de eutanasia.
2. En una campana laminar de flujo de aire, haga una pequeña incisión en el cráneo y las meninges con unas tijeras rectas de microdisección de 4,5 pulgadas. Comience a cortar desde el extremo caudal hasta el extremo rostral (nariz). Ponte debajo de la piel usando la abertura formada por la decapitación.
   1. Después de la incisión, pela uno de los hemisferios hacia un lado. Luego, use un par de pinzas curvas o en forma de gancho para extraer todo el cerebro.
3. Sumerja el cerebro en un nuevo tubo de 50 ml que contenga un 0,25% de tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) durante 15 minutos en un baño de agua a 37 °C. Use 2 mL de tripsina-EDTA por cerebro.
4. Lave el cerebro (s) con medios de crecimiento frescos (10% de suero fetal bovino (FBS), Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient mix F12 (DMEM/F12), 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de L-glutamina, 1% de piruvato de sodio y 1% de aminoácidos no esenciales) agregando y eliminando los medios. Repita esto 4 veces.
5. Para cada cerebro, coloque dos matraces T-75 que contengan medios de crecimiento. Por lo tanto, agregue 2 mL de medio de crecimiento por cerebro al tubo. Por lo tanto, será un equivalente a 1 mL de cerebro homogeneizado con 8-9 mL de medio de crecimiento por matraz T-75.
6. Homogeneizar triturando el/los cerebro/s con pipetas de diferentes tamaños de apertura, en orden de mayor a menor. Cuando sea visible que el tejido cerebral no se está reduciendo, pase a la siguiente pipeta. Al final de la trituración, la suspensión debe ser transparente, sin trozos visibles.
   1. Utilice una pipeta de 25 mL, una pipeta de 5 mL y, a continuación, una pipeta de 10 mL de forma secuencial.
7. Pase cada suspensión cerebral homogénea a través de un filtro de células de 70 μm para convertirla en un cultivo de una sola célula.
8. Para cada cerebro homogeneizado, coloque dos matraces T-75 que contengan medios de crecimiento, como se describe en el paso 1.5 (1 mL de cerebro homogeneizado con 8-9 mL de medios de crecimiento por matraz T-75).
9. Cambie el medio de crecimiento después de 6 días y crezca hasta el aislamiento el día 16.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM/F12 (1:1) (1x)	Tecnologías de la Vida	11330057
Piruvato de sodio	Tecnologías de la Vida	11360070
MEM Aminoácidos no esenciales (100x)	Tecnologías de la Vida	11140050
L-Glutamina (100x)	Tecnologías de la Vida	25030081
EDTA	Fisher Científico	AM9260G
Suero Fetal Bovino	sigma	13H469
0,25% Tripsina-EDTA	Gibco por Life Technologies	25200