Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en células similares a la microglía

Resumen

Fuente: Funes, S. et al., Células similares a la microglía humana: diferenciación a partir de células madre pluripotentes inducidas y ensayo de fagocitosis in vitro de células vivas utilizando sinaptosomas humanos.J. Vis. Exp. (2022)

Este video muestra el procedimiento de diferenciación de células pluripotentes humanas en células similares a la microglía. El proceso consiste en formar cuerpos embrioides, transferirlos a pocillos recubiertos y utilizar factores de crecimiento específicos para guiar la diferenciación en precursores primitivos de macrófagos, que finalmente se diferencian en células similares a la microglía.

Protocolo

1. Diferenciación de la microglía

NOTA: En la Figura 1 se resume una descripción general del protocolo.

1. Cultivo de células madre pluripotentes inducidas (iPSC)
   nota: Se pueden encontrar más detalles sobre las técnicas de cultivo de iPSC en otros lugares.
   1. Descongelación y mantenimiento
      1. Prepare el medio iPSC, alícuota y guárdelo a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Descongele las alícuotas durante la noche a 4 °C y utilícelas hasta por 1 semana. Deje el medio a temperatura ambiente durante al menos 1 h antes de usarlo.
      2. Cubra los pocillos de una placa de 6 pocillos añadiendo 1 mL de 10 μg/mL de laminina 521 diluida en solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco que contiene calcio y magnesio. Mantenga las placas en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ durante al menos 2 h o preferiblemente durante la noche. Una vez diluido, conservar la laminina a 4 °C durante 3 meses.
      3. Prepare 10 mM de solución madre de inhibidor de Rho quinasa Y27632 (inhibidor de ROCK) diluyendo en agua estéril. Prepare alícuotas de un solo uso de solución inhibidora de ROCK y guárdelas a -20 °C hasta por 1 año.
      4. Prepare ácido etilendiaminérgico tetraacético (EDTA) 0,5 mM diluyendo la solución madre de EDTA 0,5 M en DPBS.
      5. Para descongelar un vial de iPSC congeladas, coloque el vial en un baño de agua a 37 °C hasta que se descongele en su mayor parte. Transfiera inmediatamente el contenido del vial a un tubo cónico de 15 mL que contenga 4 mL de medio iPSC. Centrifugar a 500 × g durante 1 min.
      6. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células añadiendo lentamente 1 mL de medio iPSC que contenga 10 μM de inhibidor de ROCK contra la pared del tubo para evitar perturbar las colonias.
      7. Agregue 1,5 mL de medio iPSC que contenga 10 μM de inhibidor de ROCK a cada uno de los pocillos recubiertos y transfiera las colonias resuspendidas gota a gota a los pocillos que contienen el medio.
         nota: Utilice de 5 a 7 gotas del paso 1.1.1.6 para el mantenimiento del cultivo, pero ajuste la densidad de siembra óptima para cada línea de iPSC.
      8. Distribuya uniformemente las celdas en los pocillos moviendo manualmente la placa de lado a lado y de atrás hacia adelante. Coloque las células en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂. Al día siguiente, reemplace completamente el medio agregando medio iPSC fresco sin inhibidor de ROCK.
      9. Para el mantenimiento, cambie el medio todos los días hasta que las células alcancen el 80% de confluencia.
         nota: Las celdas se pueden mantener sin cambiar el medio durante 2 días si el medio iPSC utilizado permite un horario de alimentación flexible. Se recomienda limitar esto a un tiempo por paso y solo si las celdas tienen menos del 50% de confluentes.
   2. desdoblamiento
      1. Aspirar el medio y lavar las células con 1 mL de DPBS (sin calcio ni magnesio).
      2. Para desalojar las células, agregue 1 mL de EDTA 0.5 mM e incube durante 2-3 min a temperatura ambiente hasta que los bordes de las colonias celulares se levanten de la superficie del pocillo. Lavar las células de nuevo con DPBS y añadir 1 mL de medio iPSC.
      3. Disocie las colonias celulares raspándolas suavemente con un elevador de celdas. Raspe cada área del pozo solo una vez para evitar molestar a las colonias.
         nota: En otros lugares se pueden encontrar métodos alternativos para desalojar las colonias del pozo.
      4. Con una punta de pipeta de 1 mL, recoja las células y transfiéralas gota a gota en una proporción de 1:6 (células a medio) a pocillos prerrecubiertos (como se menciona en el paso 1.1.1.2) que contengan 1,5 mL de medio iPSC.

>2. Diferenciación de iPSC a células similares a la microglía (iMGs)

NOTA: Las moléculas pequeñas y los factores de crecimiento se disuelven en albúmina sérica bovina al 0,1% filtrada estérilmente en DPBS a una concentración de stock 1.000 veces superior a la concentración final. Se recomienda diferenciar las iPSC en iMG durante los primeros pasajes. Se aconseja el cariotipo rutinario de las líneas iPSC.

1. Preparar una solución de recubrimiento estándar
   1. Descongele la solución madre de un reactivo de recubrimiento de matriz extracelular en hielo a 4 °C durante la noche.
   2. Enfríe previamente los tubos de microcentrífuga y las puntas de las pipetas filtrantes a 4 °C.
   3. Alícuota 250 μL del reactivo de recubrimiento de matriz extracelular concentrado en cada tubo y colocar inmediatamente en hielo. Almacene las alícuotas a -20 °C.
   4. Para preparar la solución de recubrimiento, descongele una de las alícuotas del reactivo de recubrimiento de matriz extracelular en hielo a 4 °C durante la noche.
   5. Agregue 50 mL de medio helado Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient mix F12 (DMEM-F12) optimizado para el crecimiento de células madre pluripotentes embrionarias humanas e inducidas (denominadas DMEM-F12) a un tubo cónico preenfriado y manténgalo en hielo.
   6. Enfríe una punta de pipeta de 1 mL pipeteando DMEM-F12 helada hacia arriba y hacia abajo varias veces y, a continuación, utilice inmediatamente la punta de pipeta para transferir 250 μL del reactivo de recubrimiento de matriz extracelular al tubo cónico que contiene el medio DMEM-F12.
      nota: La solución de recubrimiento estándar se puede almacenar durante 2 semanas a 4 °C.
2. Formación de cuerpos embrioides (EB)
   1. Prepare un medio EB que pueda mantenerse a 4 °C durante un máximo de 4 días.
   2. Una vez que las iPSC hayan alcanzado el 80% de confluencia, disocie las colonias lavándolas con 1 mL de DPBS y agregando 1 mL de un reactivo de disociación durante 2 min a 37 °C. Desaloje las colonias usando un elevador de celdas raspando varias veces para crear una suspensión de una sola célula. Recoja las células y transfiéralo todo a un tubo cónico de 15 mL que contenga 9 mL de DPBS.
   3. Centrifugar las células a 500 × g durante 1 min, retirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 1 mL de medio EB. Tomar 10 μL de células y diluir 1:1 con azul de tripano. Cuente las células con un hematitómetro y, basándose en el recuento de células, diluya el stock de células hasta una dilución final de 10.000 células por 100 μL. Para las celdas de siembra, agregue 100 μL de las celdas diluidas por pocillo en una placa de baja adherencia, de fondo redondo, de 96 pocillos.
      nota: En general, se pueden obtener 48 pocillos de la placa de 96 pocillos de cada 80% de pocillos confluentes de iPSC.
   4. Centrifugar la placa a 125 × g durante 3 min e incubar a 37 °C y 5% de_CO2 durante 4 días. Realice un cambio de medio medio el día 2 utilizando una pipeta multicanal y recogiendo suavemente 50 μL de medio viejo, y luego volviendo a añadir 50 μL de medio EB fresco.
      nota: En el día 4, las iPSC formarán estructuras celulares esféricas denominadas EB, como se describe en la sección de resultados. El proceso de diferenciación de EB puede extenderse hasta 7 días, si es necesario.
3. Generación de precursores de macrófagos primitivos (PMPs)
   1. Prepare el medio base PMP, filtro estéril, y guárdelo a 4 °C hasta por 1 mes.
   2. Cubra los pocillos de una placa de 6 pocillos añadiendo 1 mL de solución de recubrimiento Matrigel helada e incube a 37 °C y 5% de CO₂ durante al menos 2 h o preferiblemente durante la noche.
   3. En el día 4 de la diferenciación de EB, transfiera los EB a los pocillos recubiertos de Matrigel recogiendo los EB con puntas de pipeta de 1 mL (utilizando una pipeta). Pipetear hacia arriba y hacia abajo una o dos veces para desalojar los EB del pozo. Sostenga la placa de 6 pocillos en un ángulo inclinado para permitir que los EB se asienten en el borde del pozo.
      nota: Se pueden revestir nueve o diez EB por pocillo recubierto.
   4. Una vez que todos los EB se hayan asentado, pipetee suavemente y retire el medio viejo con una punta de pipeta de 1 ml mientras mantiene los EB en el borde del pocillo. Agregue 3 mL de medio completo PMP recién preparado a cada pocillo. Distribuya uniformemente las celdas en los pocillos moviendo manualmente la placa de lado a lado y de atrás hacia adelante. Coloque la placa en la incubadora a 37 °C y 5% de CO₂.
   5. No altere la placa durante 7 días para permitir que los EB se adhieran al fondo del pozo. Después de ese tiempo, realice un cambio de medio medio utilizando el medio completo PMP.
      nota: En este punto, la mayoría de los EB deben estar unidos a la placa. Cualquier EB flotante se puede eliminar.
   6. Después de 5-7 días, inspeccione los EB bajo un microscopio de campo óptico con un aumento de 4x para asegurarse de que estén adheridos al fondo de los pocillos. Cambie el medio como se describe en 1.2.3.5. El día 21, realice un cambio completo de medio con 3 mL de medio completo PMP.
      nota: Los progenitores mieloides que flotan en el medio pueden ser evidentes en este punto. Estas celdas deben desecharse durante el cambio de medio.
   7. El día 28, busque células redondas denominadas PMP en el sobrenadante y recoja el medio que contiene las PMP con una pipeta de 10 ml y una pipeta automática. Tenga cuidado de no molestar a los EB. Transfiera los PMP y el medio a un tubo cónico de 15 mL y proceda como se describe en el paso 1.2.4.
      nota: Por lo general, los PMP de la misma línea iPSC se pueden recolectar de cinco pocillos de una placa de 6 pocillos y agruparse en un solo tubo cónico de 15 mL.
   8. Agregue 3 mL de medio completo PMP fresco para un mayor mantenimiento de los EB. Dado que los PMP emergen continuamente de los EB durante más de 3 meses, recójalos cada 4-7 días (no permita que el medio cambie de color a un tono amarillo) como se describe en los pasos 1.2.3.7 y 1.2.3.8.
      nota: Aunque las PMP se pueden recolectar durante varios meses, pueden cambiar su fenotipo con el tiempo.
4. Diferenciación a las iMG
   1. Prepare el medio base iMG (Tabla de Materiales), filtre estérilmente y guárdelo a 4 °C durante un máximo de 3 semanas.
   2. Una vez que las PMP se hayan recogido en un tubo cónico de 15 mL, centrifugarlas a 200 × g durante 4 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las PMP utilizando 1-2 mL de medio basal iMG. Cuente las células con un hemocitómetro tomando una pequeña alícuota y diluyendo 1:1 con azul de tripán.
      NOTA: Normalmente se obtienen 0,5-1,5 ×^{10 6} PMPs cada semana, dependiendo de la línea iPSC y de la edad del cultivo de EB.
   3. Centrifugar el resto de las células de nuevo a 200 × g durante 4 min. Diluir las PMPs hasta la concentración deseada de forma que las células se siembren a una densidad de ~10⁵/^cm2 en placas tratadas con cultivo celular utilizando medio completo iMG recién preparado. Realice un cambio de medio medio utilizando medio completo iMG recién preparado cada 3-4 días durante 10-12 días para permitir la diferenciación terminal.
      nota: En este punto, las células deben adquirir una morfología similar a la de la microglía. Para confirmar el compromiso de las PMPs con el destino de la microglía, se realiza un análisis de inmunofluorescencia para corroborar la expresión de marcadores enriquecidos con microglía, como el receptor purinérgico P2RY12 y la proteína transmembrana 119 (TMEM119).
   4. Para preservar la salud y viabilidad celular, realice todos los experimentos entre los días 10 y 12 de diferenciación de iMG.

Resultados

Figura 1: Esquema del protocolo para diferenciar las iPSCs en células similares a la microglía.En el día 0, una vez que las iPSC han alcanzado el 80% de confluencia, las colonias se disocian en células individuales y se cultivan en medio EB para inducir la formación de EB. En el día 4, los EB se recolectan y se siembran en medio PMP para inducir la generación de PMP. Después de 28 días, las PMP se...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Materiales de cultivo celular
Placas de 6 pocillos	Greiner Bio-One	657160
Cultivo de tejidos tratado de 100 mm x 20 mm	CELLTREAT	229620
Elevador de células, doble extremo, cuchilla plana y cuchilla estrecha, estéril	CELLTREAT	229305
Placa de 96 pocillos de fondo redondo de baja adherencia	Corning	7007
Placa de cultivo celular multipocillo modificada de superficie plana primaria de 24 pocillos	Corning	353847,
Placa de cultivo multipocillo modificada en superficie de fondo plano transparente de 6 pocillos Primaria	Corning	353846
Microplaca de fondo plano transparente de 96 pocillos Primaria	Corning	353872
Reactivos de disociación celular
Accutase	Corning	25058CI	Reactivos de disociación utilizados para la diferenciación de las neuronas motoras inferiores
Reactivo TrypLE	Tecnologías de la Vida	12-605-010	Reactivos de disociación utilizados para la diferenciación de la microglía
Ultrapuro 0,5 m EDTA, pH 8,0	Invitrogen	15575020
Reactivos de recubrimiento para cultivos celulares
Matrigel GFR Matriz de membrana	Corning™	354230	Referido al reactivo de recubrimiento de matriz extracelular
Laminina CellAdhere-521	Tecnología STEMCELL	77004	Referido a laminin 521
Poli-D-lisina	sigma	P7405	Reconstituir a 0,1 mg/mL en tampón de borato
Poli-L-Ornitina	sigma	P3655	Reconstituir a 1 mg/mL en tampón de borato
Componentes de los medios iPSC
Kit mTeSR Plus	Tecnología STEMCELL	100-0276	Para preparar los medios iPSC, mezcle los componentes a 1x
Componentes de los medios EB
BMP-4	Fisher Científico	PHC9534	Concentración final 50 ng/mL
Medios iPSC			Concentración final 1x
Inhibidor de ROCK Y27632	Fisher Científico	BD 562822	Concentración final 10 μM
Scf	PeproTech	300-07	Concentración final 20 ng/mL
VEGF	PeproTech	100-20A	Concentración final 50 ng/mL
Componentes de los medios base PMP
GlutaMAX	Gibco	35050061	Concentración final 1x
Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Concentración final 100 U/mL
X-VIVO 15	Lonza	12001-988	Concentración final 1x
Componentes de los medios completos PMP
55 mM 2-mercaptoetanol	Gibco	21985023	Concentración final 55 μM
IL-3	PeproTech	200-03	Concentración final 25 ng/mL
M-CSF	PeproTech	300-25	Concentración final 100 ng/mL
Medios base PMP			Concentración final 1x
Componentes de los medios base iMG
DMEM/F12 avanzado	Gibco	12634010	Concentración final 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	Concentración final 1x
Suplemento de N2, 100x	Gibco	17502-048	Concentración final 1x
Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Concentración final 100 U/mL
Componentes de los medios completos iMG
55 mM 2-mercaptoetanol	Gibco	21985023	Concentración final 55 μM
IL-34	PeproTech o Biologend	200-34 o 577904	Concentración final 100 ng/mL
Medios base iMG			Concentración final 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	Concentración final 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	Concentración final 50 ng/mL
Componentes de los medios base de inducción
DMEM/F12 con HEPES	Gibco	11330032	Concentración final 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	Concentración final 1x
Suplemento de N2, 100x	Gibco	17502-048	Concentración final 1x
Aminoácidos no esenciales (NEAA), 100x	Gibco	11140050	Concentración final 1x
Componentes de los medios de inducción completos
Compuesto E	Calbiochem	565790	Concentración final de 0,2 μM y reconstitución del reactivo madre a 2 mM en etanol 1:1 y DMSO
doxiciclina	sigma	D9891	Concentración final 2 μg/mL y reconstitución del reactivo madre a 2 mg/mL en DPBS
Medios de base de inducción			Concentración final 1x
Inhibidor de ROCK Y27632	Fisher Científico	BD 562822	Concentración final 10 μM
Otros reactivos de cultivo celular
Azul de tripano, solución al 0,4%	AMRESCO INC	K940-100ML
Albúmina sérica bovina (BSA)	sigma	22144-77-0
DPBS con Calcio y magnesio	Corning	21-030-CV
DPBS sin calcio y magnesio	Corning	21-031-CV	Referido a DPBS
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	Denominado DMEM-F12 optimizado para el crecimiento de células madre pluripotentes embrionarias e inducidas humanas
Laminina Proteína de Ratón, Natural	Gibco	23017015	Referido a la laminina