Establecimiento de un cultivo de células gliales de Müller obtenido de retinas de ratón

Descargo de responsabilidad: Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Disociación de la retina

NOTA: Todos los pasos siguientes (hasta la recolección de células) deben llevarse a cabo en una cabina de bioseguridad (BSC) A2 o B2.

1. Prepare la mezcla de disociación Papaína/DNasa I de la siguiente manera.
   1. Para seis retinas, agregue 75 μL de DNasa I en el tubo que contiene 750 μL de papaína y mezcle cuidadosamente (mezcla de disociación).
   2. Para la preparación de muestras individuales requerida para este protocolo, divida el volumen total de 825 μL en tres alícuotas: 275 μL de la mezcla en un tubo de 1,5 mL por ratón (dos retinas). Calcule las cantidades requeridas de DNasa I y papaína en consecuencia.
      nota: Se pueden disociar hasta seis retinas en un tubo de mezcla de papaína y DNasa I. Sin embargo, la preparación individual de la muestra da como resultado menos grupos y un mejor crecimiento celular que las muestras combinadas.
2. Transfiera dos retinas a una mezcla de disociación de papaína/DNasa I. Utilice una pipeta de transferencia con un diámetro de punta agrandado, recoja las retinas, espere hasta que las retinas se asienten en la parte inferior de la punta y, a continuación, libere las retinas sin exceso de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) en el tubo que contiene la mezcla de papaína y DNasa I.
3. Colocar en un nutator e incubar durante 10 min en una incubadora de cultivos celulares (37 °C, 5% CO₂).
4. Disocie las células pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo (unas 20-30 veces) con una pipeta de 1 mL. Después de que las células se disocien (es decir, lo que da como resultado una solución homogénea sin trozos), agregue 275 μL de inhibidor de la proteasa ovomucoide del kit de disociación de papaína para neutralizar la papaína. Mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. NOTA: Si seis retinas se disociaron en 825 μL de mezcla de papaína/DNasa I, se requieren 825 μL de Ovomucoide.
5. Centrifugar la mezcla a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
6. Añadir factor de crecimiento epidérmico (EGF, 1 μL por 1 mL del medio de crecimiento, reconstituido a 200 μg/mL en PBS) al volumen calculado del medio de crecimiento (1 mL por ratón) precalentado a 37 °C.
   NOTA: Dependiendo del diseño experimental, al comienzo del período de cultivo se puede agregar el marcador de proliferación 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), así como 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) u otros factores requeridos.
7. Retire los tubos con cuidado de la centrífuga. No toque el pellet en la parte inferior del tubo.
8. Retire el sobrenadante con cuidado y por completo. Vuelva a suspender el pellet celular con 500 μL de medio de crecimiento suplementado con EGF.
9. Transfiera la suspensión celular a un pocillo de la placa de 12 pocillos etiquetada (Figura 1C). Enjuague el tubo con otros 500 μL del medio de crecimiento suplementado con EGF y agréguelo al pocillo (volumen total de 1 mL por pocillo).
10. Repita los pasos 1.8 y 1.9 con todas las demás muestras.
11. Balancee la placa del pozo tres veces con cuidado (hacia adelante y hacia atrás; izquierda y derecha). Coloque la placa en la incubadora (37 °C, CO₂).
    nota: Si se utilizan ratones transgénicos, se debe realizar el genotipado de cada animal (Figura 1D). Identifique los ratones Cre recombinasa positivos y negativos y etiquete la placa en consecuencia. Para este protocolo, solo se utilizaron células de ratones reporteros positivos para la recombinasa Cre para los siguientes pasos. Las células de las muestras Cre negativas se congelan y se utilizan para otras aplicaciones.

2. Fase de crecimiento

NOTA: La fase de crecimiento tiene una duración de unos 4-5 días (Figura 2B). Para agregar líquidos a pocillos que contienen celdas, la pipeta debe apuntar a la pared del pocillo y el líquido debe liberarse lentamente para evitar el desprendimiento de la célula. No pipetee directamente sobre las células.

1. Un día después de la disociación, retire el medio y agregue 1 ml de medio de crecimiento fresco suplementado con EGF.
2. El día 3, retire el medio y agregue 1 mL de HBSS (temperatura ambiente) para eliminar los desechos celulares. Muévete suavemente de un lado a otro de izquierda a derecha. Retire el HBSS, repita el paso de lavado y agregue 1 ml de medio de crecimiento precalentado con suplementos de EGF.
3. Monitoree las células todos los días y evalúe su estado de crecimiento hasta que las células alcancen el 90%-100% de confluencia. La Figura 3 muestra un ejemplo de buen crecimiento de MG a lo largo del tiempo. Compruebe si hay posible contaminación o muerte celular. Deseche los cultivos contaminados.
   nota: Para monitorear y registrar el estado de la célula, tome imágenes a varios aumentos utilizando un microscopio óptico con una cámara conectada y objetivos de 4x, 10x o 20x. En este estudio se utiliza un microscopio de fluorescencia.

>3. Preparación de cubreobjetos con capa de poli-L-ornitina (Poly-O) y laminina

NOTA: Este paso solo es necesario si se realiza el marcaje inmunofluorescente y la microscopía de barrido láser confocal. Se requieren cubreobjetos de vidrio redondos (12 mm de diámetro) para obtener imágenes adecuadas. El protocolo de recubrimiento también se puede encontrar en la ficha técnica del medio neuronal (ver Tabla de Materiales).

1. Coloque cuidadosamente los cubreobjetos estériles en el centro de cada pocillo de una placa de 24 pocillos con pinzas de #2AP Dumont estériles.
   nota: Coloque cubreobjetos en el centro del pozo. Colocar cubreobjetos cerca de la pared de un pozo causará problemas de tensión superficial para los siguientes pasos.
2. Descongele una alícuota de Poly-O de 2,5 ml a temperatura ambiente y coloque 100 μL en el centro de cada cubreobjetos.
3. Incubar la placa de pocillos durante 30 min en una incubadora a 37 °C.
4. Retire el Poly-O y lave el pozo con el cubreobjetos tres veces con ~1 ml de agua estéril.
5. Deje que la placa del pocillo se seque durante la noche en el BSC. Descongele 2,5 mL de laminina a 4 °C durante la noche.
6. A la mañana siguiente, añadir 100 μL de laminina en el centro de cada cubreobjetos e incubar durante 4 h en una incubadora a 37 °C.
7. Retire la laminina con cuidado y por completo.
8. Mantenga la placa a 4 °C si el paso no se puede realizar inmediatamente.
   nota: Los cubreobjetos recubiertos en placas preparadas se pueden mantener durante unos días a 4 °C.

>4. Paso celular para eliminar supervivientes neuronales

>NOTA: El paso celular es necesario para eliminar las células neuronales, no para aumentar la población celular. Glia se divide solo unas pocas veces y no crecerá más después del paso. No diluir las suspensiones celulares. Las celdas de un pozo confluente de una placa de 12 pocillos se pueden distribuir en un pocillo de una placa de 12 pocillos o en dos pocillos de una placa de 24 pocillos. Cuando se utilizan cubreobjetos recubiertos, solo se recubre alrededor de un tercio del cubreobjetos. Por lo tanto, se pueden obtener seis cubreobjetos colocados en una placa de 24 pocillos, con células confluentes (~ 80%-90%) de un pocillo de células confluentes de una placa de 12 pocillos. También se pueden elegir otras proporciones para aumentar o disminuir la densidad celular. Para este protocolo, se utiliza un ratón reportero Cre+ [un experimento, dos tratamientos: miR-25 o control-miR; réplicas técnicas n = 3 (tres cubreobjetos por tratamiento), réplicas biológicas n = 1]. El número de réplicas técnicas y biológicas puede definirse de forma diferente en función del diseño experimental.

1. Compruebe si las celdas son 90%-100% confluentes (también en el margen del pozo; Figura 3E,F).
2. Retire el medio y agregue 1 mL de HBSS (temperatura ambiente) para lavar. Mueva suavemente el plato (hacia adelante y hacia atrás, hacia la izquierda y hacia la derecha). Elimine HBSS por completo.
3. Añadir 500 μL de una solución precalentada que contenga tripsina (precalentada a 37 °C en un baño de perlas metálicas) para separar las células del pocillo. Meca suavemente (de un lado a otro, de izquierda a derecha) e incube durante 2 minutos en una incubadora a 37 °C.
4. Mueva la placa de la incubadora a BSC. Mientras se inclina, aspire la solución que contiene tripsina y distribúyala con cuidado y lentamente sobre el pocillo varias veces hasta que las células se desprendan por completo. Sostenga el plato a contraluz y asegúrese de que no queden celdas en la parte inferior.
5. Transfiera esta suspensión celular a un tubo estéril de 1,5 mL. Centrifugar a 300 x g durante 8 min a 4 °C.
6. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender con cuidado el pellet de la célula añadiendo 600 μL (100 μL por pocillo para 6 pocillos/cubreobjetos) de medio de crecimiento precalentado (suplementado con EGF; 1:1000). y pipeteando hacia arriba y hacia abajo ~ 30-40 veces.
   nota: Las células se pueden congelar en este momento a -80 °C o en nitrógeno líquido y descongelar siguiendo los protocolos estándar para la descongelación de líneas celulares. Si las células se congelan, no se resuspenderán en un medio suplementado con EGF (medio de crecimiento). Se resuspenderán en un medio básico (sin FEAG) y en una solución de congelación (proporción 1/1).
7. Células de siembra colocando 100 μL de la suspensión de células/medios de 600 μL en el centro de seis cubreobjetos recubiertos (consulte el paso 5) de la placa de 24 pocillos. Coloque la placa con cuidado en la incubadora y deje que las células se asienten.
   NOTA: 100 μL de la suspensión celular de 600 μL (recolectada de un pocillo de una placa de 12 pocillos) darán como resultado una confluencia celular del 90% al 100%, que se requiere para la transfección.
8. Revise las celdas después de 3 h para ver si se han asentado en el cubreobjetos. Añadir 400 μL de medio de crecimiento suplementado con EGF.
   NOTA: Las células suelen estar listas para la transfección al día siguiente (Figura 3G). Si no son confluentes (90%-100%), déjalos para otro día. Si aún no son confluentes, no los use para la transfección. Si se llevan a cabo otras aplicaciones posteriores, como el perfil de miARN, la secuenciación de ARN, la RT-qPCR o la transferencia occidental, las células deben pasarse a placas de 12 pocillos (proporción 1:1; no se requiere tratamiento con placas) y recolectarse para la extracción de ARN/proteína.

Figura 1: Disociación de retina y genotipado. (A) Ocular con córnea, cristalino, iris y vítreo extraídos. (B) Retinas aisladas; Las células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR) se eliminan después de un lavado a fondo. (C) Placa de 12 pocillos con retinas disociadas (dos retinas por pocillo). (D) Ejemplo de recorte de una imagen de gel de genotipado. El genotipado es necesario para identificar los ratones que tienen expresión de recombinasa Cre impulsada por Ascl1 y se utilizará para rastrear la conversión celular. Barras de escala: 1 mm.

Figura 2: Diseño experimental y curso temporal de un cultivo primario de Müller glia. (A) Esquema del ratón Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl, un ratón reportero progenitor de la retina utilizado para rastrear la conversión de la glía de Müller (MG) en células progenitoras de la retina (RPC). (B) Curso temporal de los períodos de cultivo que consta de fase de crecimiento (azul, 0-4/5 días in vitro, div), fase de transfección (púrpura, 5/6-7/8 div) y fase de conversión MG (amarillo, comienza 7/8 div). Fase de crecimiento: las retinas disociadas (dos retinas de un ratón) crecen en un pocillo de una placa de 12 pocillos en un medio de crecimiento. Alrededor del día 4/6, las células se introducen en una placa de 24 pocillos que contiene cubreobjetos recubiertos. Fase de transfección: 5-7 div (1 día después del paso) las células se transfectan con miRNAs durante 2 días en medio de transfección. La recombinasa Cre se activa con 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT). La proliferación celular se rastrea con EdU. La fase de conversión de MG comienza 1 día después de la transfección. Las células ahora se cultivan en el medio neuronal hasta la cosecha (6-7 días después de las transfecciones, dpTF).

Figura 3: Glía primaria de Müller durante la fase de crecimiento. (A) El curso temporal de los períodos de cultivo durante la fase de crecimiento (0-4/5 días in vitro (div)) se resalta en azul. (B-G) Imágenes en vivo (fase) de la glía de Müller (MG) durante la fase de crecimiento después de 1 div (B), 2 div después del cambio de medio (C), 3 div (D), 4 div antes del paso (E,F) y 5 div, 1 día después del paso y antes de la transfección (G). Los cuerpos de las células MG se indican con puntas de flecha rojas. Después de 3 div, los cultivos son 60%-80% confluentes (D), después de 4-5 div, los cultivos son 90%-100% confluentes y listos para ser pasados (E-F). Después de pasar por los cubreobjetos, los cultivos celulares deben tener una confluencia del 80%-90% para la transfección posterior (G). Barras de escala: 50 μm (A-D), 100 μm (E), 200 μm (F).