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Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Preparación del tampón
NOTA: Si realiza una secuenciación de ARN posterior, trate minuciosamente todos los espacios de trabajo y herramientas con la solución de descontaminación de ARNasa para evitar la degradación del ARNm.
- Prepare el tampón de lisis.
- Disolver en agua destilada (H2O) hasta 50 mL: 5,47 g de sacarosa (0,32 M final), 250 μL de cloruro cálcico (CaCl2) 1 M (5 mM final), 150 μL de acetato de magnesio 1 M (Mg(CH3COO)2)(3 mM final), 10 μL de 500 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (0,1 mM final), 500 μL de ácido tricis-clorhídrico (Tris-HCl) (pH 8) (10 mM final), 50 μL de Triton X-100 (0,1% final) y 17 μL de 3 M de ditiotreitol (DTT, 1 mM final, añadir fresco) (ver Tabla de Materiales).
- Preparar el tampón de sacarosa
- Disolver lo siguiente en H2O destilado hasta 50 mL: 30,78 g de sacarosa (1,8 M final), 150 μL de 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM final), 500 μL de 1 M de Tris-HCl (pH 8) (10 mM final), 17 μL de 3 M de DTT (1 mM final, añadir fresco).
2. Disociación de tejido congelado en suspensión de un solo núcleo
- Agregue 4 mL de tampón de lisis helado a un dosuncer (molinillo) de papel tisú de vidrio de 7 mL y manténgalo en hielo. Diseccionar aproximadamente 200-400 mg de la corteza adulta humana recién congelada, rezumar aproximadamente 50 veces y transferir el homogeneizado de tejido a un tubo de polipropileno ultracentrífugo de 12 mL.
- Con una pipeta de 5 mL, agregue 6,5 mL de tampón de sacarosa helada al fondo del tubo de ultracentrífuga, teniendo cuidado de no alterar la capa entre la sacarosa y el homogeneizado >
NOTA: Si procesa muestras adicionales, equilibre cuidadosamente los tubos por peso agregando tampón de lisis adicional a la muestra más ligera. El equilibrado preciso de los tubos de ultracentrífuga es esencial para evitar daños en el rotor y garantizar la rotación a la velocidad adecuada.
3. Ultracentrifugación
- Ultracentrífuga el lisado a 24.400 rpm (101.814 × g) durante 1 h a 4 °C. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y los residuos sin alterar el pellet.
nota: Es posible que un gránulo no sea visible si se comienza con menos de 200 mg de tejido.
- Añadir 600 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (libre de calcio (Ca2+), magnesio (Mg2+)) al pellet del núcleo e incubar en hielo durante 10 min antes de volver a suspender.
- Pipetear hacia arriba y hacia abajo 50 veces para volver a suspender los núcleos en gránulos.
- Utilice un hemocitómetro para visualizar los núcleos intactos bajo un microscopio y asegurarse de que la concentración de la resuspensión esté por encima de 105 núcleos/ml antes de pasar al siguiente paso (combine 10 μL de los núcleos resuspendidos con 10 μL de azul de tripán).
4. Incubación de anticuerpos
- Para inmunomarcar la muestra para la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FANS), agregue 500 μL del pellet de muestra resuspendido, 490 μL de 1x PBS (libre de Ca2+, Mg2+), 10 μL de albúmina sérica bovina (BSA) al 10% (0,1% final), 1 μL de anticuerpo anti-NeuN de ratón conjugado con AF(Alexa fluor)555 (NeuN-AF555, concentración final 1:1000), y 1 μL de anticuerpo anti-PAX6 de ratón conjugado con aloficocianina (PAX6-APC, concentración final 1:1000)
nota: Se pueden añadir anticuerpos alternativos conjugados con otros fluoróforos. En este caso, se utilizó anti-OLIG2 de ratón conjugado con AF488 (concentración 1:1000) con resultados favorables.
- Realice controles de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) solo y de un solo color para configurar los parámetros de compuerta, utilizando una pequeña cantidad de la muestra según sea necesario.
- Para realizar un control de un solo color AF555, agregue 20 μL del pellet de muestra resuspendido, 970 μL de 1x PBS (libre de Ca2+, Mg2+), 10 μL de BSA al 10% (0,1% final) y 1 μL de anticuerpo NeuN-AF555 (concentración 1:1000).
- Para realizar un control de un solo color de APC, agregue 20 μL del gránulo de muestra resuspendido, 970 μL de PBS 1X (libre de Ca2+, Mg2+), 10 μL de BSA al 10 % (0,1 % final) y 1 μL de anticuerpo PAX6-APC (concentración 1:1000).
- Para realizar el control solo con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol), agregue 20 μL del pellet de muestra resuspendido, 970 μL de PBS 1X (libre de Ca2+, Mg2+) y 10 μL de BSA al 10% (0.1% final) (DAPI se agregará más adelante, ver 4.4)
nota: Si se utilizan más de dos anticuerpos, se recomienda realizar un control de fluorescencia menos uno (FMO) además de los controles de un solo color.
- Incubar las muestras y los controles con rotación en la oscuridad durante 1 h a 4 °C.
- Agregue DAPI a 1:1000 a todas las muestras y controles, y proceda con la clasificación.