>Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Recolección de tejidos
- Prepare el tampón X del kit de disociación neuronal añadiendo beta-mercaptoetanol al tampón X hasta una concentración final de 0,067 mM (para 4 muestras, añadir 13,5 μl de 50 mM de beta-mercaptoetanol a 10 ml de tampón X).
- Prepare la mezcla de enzimas 1 mezclando 50 μl de enzima P con 1.900 μl de tampón X para cada muestra, tal como se describe en el protocolo del kit de disociación neuronal. Por ejemplo, para 4 muestras, mezcle 200 μl de enzima P con 7.600 μl de tampón X.
- Colocar el Tampón X en el baño maría a 37 ºC.
- Coloque 2 ml de solución salina tamponada de Hank's fría (HBSS) (sin Ca++ y Mg++) en un pocillo de una placa de cultivo estéril de 6 pocillos para cada muestra que se recogerá y se mantendrá en hielo para la disección del tejido.
>2. Disociación neuronal (1 hora)
- Corta cada muestra de tejido en pedazos pequeños con hojas de afeitar estériles en la tapa de la placa de cultivo de 6 pocillos. Este protocolo se ha utilizado para muestras de tejido de aproximadamente 30 a 100 mg, pero está aprobado para muestras de tejido de hasta 400 mg. En el caso de muestras de tejido de más de 400 mg, los volúmenes de reactivos deben ampliarse adecuadamente.
- Utilice 1 ml de HBSS fresco sin Ca2+ y Mg2+ para transferir los trozos de tejido cortados en cubitos con una pipeta a un tubo de centrífuga estéril de 2 ml. Repita los pasos 2.1 y 2.2 para todas las muestras hasta que todas las muestras se hayan transferido a un tubo de centrífuga de 2 ml.
- Centrifugar las muestras a 300 x g durante 2 min a RT y aspirar sobrenadante.
- Añada 1.900 μl de Enzyme Mix 1 tibia, como se preparó en los pasos 1.2 y 1.3, a cada muestra y cierre los tubos.
- Incubar las muestras durante 15 min en el baño de agua a 37 ºC, invirtiendo los tubos varias veces cada 5 min para volver a suspender los trozos de tejido sedimentados.
- Mientras tanto, prepare la mezcla de enzimas 2 mezclando 20 μl de tampón Y con 10 μl de enzima A descongelada (para 4 muestras, mezcle 80 μl de tampón Y con 40 μl de enzima A descongelada).
- Añadir 30 μl de Enzyme Mix 2 a cada muestra e invertir suavemente. No haga vórtice.
- Disocie cada muestra de tejido con la pipeta Pasteur "1", triturando hacia arriba y hacia abajo 30 veces.
- Incubar las muestras durante 15 min en el baño de agua a 37 ºC; invertir los tubos varias veces cada 5 min para volver a suspender los trozos de tejido sedimentados.
- Disociar cada muestra de tejido con la pipeta Pasteur "2", triturando hacia arriba y hacia abajo 30 veces, evitando generar burbujas.
- Disociar cada muestra de tejido con la pipeta Pasteur "3", triturando hacia arriba y hacia abajo 30 veces, evitando generar burbujas.
- Incubar las muestras durante 10 min en el baño de agua a 37 ºC; invertir los tubos varias veces cada 5 min para volver a suspender las células sedimentadas.
- Aplique la suspensión unicelular a una cepa celular de 80 micras colocada encima de un tubo falcon de 15 ml para eliminar cualquier pieza grande de residuos y lave el filtro y las células con 10 ml de HBSS (con Ca2+ y Mg2+) para detener las reacciones enzimáticas. Repita hasta que cada muestra se transfiera a un tubo de halcón limpio de 15 ml.
- Centrifugar las muestras a 300 x g durante 10 min a RT y aspirar el sobrenadante.
>3. Agotamiento de mielina (45 min)
- Vuelva a suspender completamente el pellet de células con 400 μl de tampón de eliminación de mielina.
- Agregue una cantidad específica de las perlas de eliminación de mielina y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar completamente.
nota: El volumen de las perlas de eliminación de mielina utilizadas dependerá del tamaño del tejido, la edad del animal y la cantidad de mielina que se espera en esa región particular del cerebro. Por ejemplo, para una muestra de hipocampo de rata adulta (aproximadamente 300 mg), incube la muestra con 100 μl de perlas de eliminación de mielina.
- Incubar durante 15 min en el frigorífico a 4 ºC.
- Lave cada muestra con 5 ml de tampón de eliminación de mielina.
- Centrifugar las muestras a 300 x g durante 10 min en RT.
- Mientras centrifuga las muestras, coloque 1 columna para cada muestra en el campo magnético del clasificador magnético y coloque un filtro limpio de 80 micras encima de cada columna.
- Prepare las columnas y filtre enjuagando cada columna con 1 ml de tampón de eliminación de mielina tres veces (3 ml en total). Recoja todo el flujo en un contenedor de residuos, como el fondo de una caja de propinas vacía.
- Coloque un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml directamente debajo de cada columna en preparación para la recolección de muestras.
- Cuando las células hayan terminado de centrifugarse, aspire el sobrenadante y vuelva a suspenderlo completamente en 500 μl de tampón de eliminación de mielina. Aplique inmediatamente la suspensión de celdas a la columna y recoja las celdas en el tubo de abajo.
- Lave el filtro y la columna con 1 ml de tampón de eliminación de mielina, 4 veces (4 ml en total).
- Centrifugar la recolección de células a 300 x g durante 10 min en RT.
- Aspire el sobrenadante y las células ya están listas para la tinción.
>4. Tinción de células vivas para FACS (1 hora para la tinción)
- Agitar brevemente las celdas en vórtice (2 seg) para separar el pellet e inmediatamente añadir 5 μl de bloque Fc (anti-clusters de diferenciación 32, CD32), vórtice de nuevo, e incubar en el frigorífico a 4 ºC durante 5 min.
- Mientras tanto, prepare la mezcla de anticuerpos primarios agregando los tres anticuerpos primarios en el tampón de lavado de la siguiente manera: 0,125 μl de anticuerpo CD11b conjugado con aloficocianina (APC) (1:800), 1 μl de anticuerpo anti-GLT1 (1:100) y 0,4 μl de isotiocianato de fluoresceína (FITC) – anticuerpo Thy1 conjugado (1:250) por cada 100 μl de tampón de lavado. Cada muestra recibirá 100 μl de mezcla de anticuerpos primarios para la incubación; Sin embargo, si su muestra es mucho más grande que 400 mg de tejido, es posible que desee considerar aumentar el volumen de su mezcla de anticuerpos primarios en consecuencia
- Prepare los tubos para los controles de tinción individuales extrayendo solo 2 μl de células de cada tubo de muestra y agregándolo a cada tubo de control de tinción individual. Los controles de "tinción única" incluyen: APC-CD11b solamente, GLT1 solamente, FITC-Thy1 solamente, anticuerpo secundario PE solamente, y el control "en blanco" o sin teñir.
nota: Todas las muestras deben estar representadas en todos los controles de tinción, por lo que se deben añadir 2 μl de células de cada muestra a cada tubo de control de tinción.
- Agite brevemente los tubos (2 segundos) y agregue 100 μl de mezcla de anticuerpos primarios a cada tubo de muestra y 100 μl de anticuerpo primario apropiado a cada tubo de control de tinción, vuelva a hacer un vórtice de los tubos, cubra los tubos con papel de aluminio para proteger los anticuerpos fluorescentes de cualquier luz e incube los tubos en el refrigerador a 4 ºC durante 20 minutos. Las muestras deben mantenerse frías (a 4 ºC) durante el resto del procedimiento para mantener la integridad de las muestras y de los anticuerpos.
- Agite brevemente los tubos y agregue 2 ml de tampón de lavado a cada tubo.
- Tubos de centrífuga a 350 x g durante 5 min a 4 ºC.
- Mientras tanto, prepare la mezcla de anticuerpos secundarios añadiendo 0,2 μl de anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con PE por cada 100 μl de tampón de lavado. Cada muestra recibirá 100 μl de mezcla de anticuerpos secundarios; Sin embargo, si su muestra es mucho más grande que 400 mg de tejido, es posible que desee considerar aumentar el volumen de su mezcla de anticuerpos primarios en consecuencia.
- Cuando se complete la centrifugación, vierta el sobrenadante de cada muestra en el fregadero y seque los tubos boca abajo sobre una toalla de papel.
- Agite brevemente los tubos y añada 100 μl de mezcla de anticuerpos secundarios a cada tubo de muestra y el anticuerpo secundario adecuado a cada control de tinción. A continuación, vuelve a vorexear los tubos, cúbrelos con papel de aluminio e incuba en el frigorífico a 4ºC durante 15 min.
nota: El tubo de control de tinción solo GLT1 debe recibir la mezcla de anticuerpos secundarios.
- Después de la incubación, agite brevemente los tubos y agregue 2 ml de tampón de lavado a cada tubo.
- Centrifugar los tubos a 350 x g durante 5 min a 4ºC.
- Cuando se complete la centrifugación, vierta el sobrenadante de cada muestra en el fregadero y seque los tubos boca abajo sobre una toalla de papel.
- Agite los tubos y agregue 0,25 ml de PBS estéril a cada tubo. Las muestras están listas para ser clasificadas.
nota: Más células pueden requerir 0,5 ml de PBS estéril; Sin embargo, es mejor comenzar con un volumen más bajo><, ya que la muestra siempre se puede diluir si está demasiado concentrada con células.
nota: Opcionalmente, agregue DNasa al tubo para evitar que las células se agrupen y, por lo tanto, obstruyan el clasificador. Las muestras también se pueden filtrar utilizando un filtro estéril de 80 micras justo antes de la clasificación para evitar obstruir el clasificador.
