1. Preparación y recolección de gusanos envejecidos para el aislamiento celular
- Recoja los gusanos y prepare los tampones para el aislamiento de las células.
- Recoja las lombrices en un tubo cónico de 15 ml. Lave los gusanos de la placa con 1,5 mL de tampón M9 (1 mM MgSO4, 85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO4, pH 7,0) y centrifugue durante 5 min a 1.600 x g. Deseche el sobrenadante y lave las lombrices con 1 mL de tampón M9. Repita la centrifugación y lave un total de cinco veces para eliminar la mayor cantidad posible de contaminación por Escherichia coli.
NOTA: La adición de antibióticos (50 μg/mL), como la ampicilina, en este paso puede ayudar a reducir la contaminación bacteriana.
- Para dos muestras, prepare 2 mL de tampón de lisis de dodecil sulfato-ditiotreitol de sodio (SDS-DTT): 200 mM de DTT, 0,25% (p/v) de SDS, 20 mM HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinenetanosulfónico) (pH 8,0) y 3% (p/v) de sacarosa.
- Prepare 15 mL de tampón de aislamiento (118 mM de NaCl, 48 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 2 mM de MgCl2, 25 mM de HEPES [pH 7.3]) y guárdelo en hielo.
nota: Tanto el tampón de lisis SDS-DTT como el tampón de aislamiento deben renovarse antes de cada experimento.
- Disrupción de la cutícula y aislamiento de una sola célula
- Centrifugar los animales recogidos en el paso 1.1.1 durante 5 min a 1.600 x g. Retire todo el sobrenadante y suspenda los gusanos en 1 mL de medio M9 y transfiéralo al tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Gusanos en pellets con centrifugación a 1.600 x g durante 5 min.
- Añadir 200 μL de tampón de lisis SDS-DTT a los gusanos e incubar durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Los gusanos deben parecer estar "parpadeando" a lo largo del cuerpo si se observan con un microscopio óptico.
nota: La exposición prolongada al tampón de lisis SDS-DTT puede provocar la muerte de los gusanos, lo que puede controlarse mediante la observación de los gusanos. Los gusanos que están muertos se alargarán y no se enroscarán.
- Agregue 800 μL de tampón de aislamiento helado y mezcle moviendo suavemente el tubo.
- Pellet worms durante 1 min a 13.000 x g a 4 °C, eliminar el sobrenadante y lavar con 1 mL de tampón aislante.
- Repita el paso 1.3.5 un total de cinco veces, retirando cuidadosamente el búfer de aislamiento cada vez.
- Añadir 100 μL de mezcla de proteasa de Streptomyces griseus (15 mg/mL) (Tabla de Materiales) disuelta en tampón de aislamiento al pellet e incubar durante 10-15 min a RT.
nota: Al igual que con el tampón de lisis SDS-DTT, la digestión extendida de la proteasa puede resultar en una escisión excesiva de proteínas a lo largo de la membrana plasmática, lo que impide el aislamiento de la proteína fluorescente verde (GFP) expuesta a la superficie a través de perlas magnéticas.
- Durante la incubación con mezcla de proteasas, aplique la interrupción mecánica pipeteando las muestras hacia arriba y hacia abajo contra el fondo del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con una punta de micropipeta de 200 μl ~60-70 veces. Mantenga la punta de la pipeta contra la pared del tubo de microcentrífuga con presión constante para disociar correctamente las células.
- Para determinar la etapa de la digestión, extraiga un pequeño volumen (~ 1-5 μL) de la mezcla de digestión, colóquelo en un portaobjetos de vidrio e inspecciónelo con un microscopio de cultivo de tejidos. Después de 5-7 minutos de incubación, los fragmentos de gusano deberían tener una cutícula visiblemente reducida y una suspensión de células será fácilmente visible.
- Detener la reacción con 900 μL de medio L-15 frío disponible comercialmente suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y penicilina-estreptomicina (concentración final a 50 U/mL de penicilina y 50 μg/mL de estreptomicina).
- Pellet aisló fragmentos y células por centrifugación durante 5 min a 10.000 x g a 4 °C. Lave las celdas peletizadas con 1 mL de medio frío suplementado con L-15 dos veces más para asegurarse de que se elimina el exceso de residuos y cutículas.
- Vuelva a suspender las células peletizadas en 1 ml de medio suplementado con L-15 y déjelas actuar en hielo durante 30 minutos. Lleve la capa superior, aproximadamente 700-800 μL, a un tubo de microcentrífuga. Esta capa contiene celdas sin restos de celdas y se utilizará en el aislamiento posterior de celdas de interés.
- Siguiendo las instrucciones del fabricante, utilice un contador de células automatizado o un hemocitómetro para medir la densidad celular de 10-25 μL de células aisladas.
>2. Aislamiento de células GFP-positivas mediante citometría de flujo
- Aislamiento de células GFP-positivas por citometría de flujo
- A partir de la suspensión celular aislada recogida en el paso 1.2.12, centrifugar las células durante 5 min a 10.000 x g a 4 °C. Deseche el sobrenadante y suspenda las células granuladas en un medio suplementado con L-15 hasta una densidad celular de no más de 6 x 106 células/mL para evitar sobrecargar el citómetro de flujo.
- Ordene las células por expresión GFP positiva utilizando un citómetro de flujo capaz de clasificar muestras. Las células negativas a GFP se pueden utilizar como control para el análisis no específico del tipo de célula.
- Cultivo de células aisladas
- Coloque las células aisladas en una placa estéril de 6 pocillos múltiples.
nota: Estas placas pueden estar recubiertas con lectina de maní para aumentar la adhesión celular; Sin embargo, si las celdas se van a utilizar inmediatamente, este paso puede ignorarse.
- Coloque la placa en un recipiente de plástico e incube las células a 20 °C con una toallita húmeda o papel de seda suave (agregue 50 μg/mL de ampicilina al agua destilada doble [ddH2O] para asegurarse de que no haya crecimiento bacteriano en la toallita) para agregar humedad a las células. No incube en una incubadora de CO2, ya que los niveles elevados de CO2 pueden dañar las células.
