Obtención de rodajas de cerebelo a partir del cerebro de un pollito embrionario

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Disección de embrión de pollo Día 14 (e14) Cerebelo

1. Incubar huevos de gallina marrón fertilizados a 38 °C hasta el día 14 embrionario.
2. Con unas tijeras de huevo, decapitar el embrión de pollo in ovo y retirar la cabeza a una placa de Petri que contenga solución salina tampón de fosfato (PBS) helada (Figura 1A).
3. Con pinzas estándar, haga incisiones detrás de cada ojo a través del tejido, extirpando los ojos y la mandíbula superior. Realice una segunda incisión a través de la faringe, extirpando la mandíbula inferior (Figura 1B).
4. Con pinzas estándar, extraiga toda la piel de la superficie del cráneo despegándola (Figura 1C) y extraiga los huesos frontales y parietales, revelando el cerebro.
5. Desde el aspecto ventral, extirpar el cartílago faríngeo y el mesénquima auxiliar.
6. Desde el aspecto dorsal, retire con cuidado el mesénquima dorsal al cerebro posterior, teniendo cuidado de no dañar la pia, y separe todo el cerebro (Figura 1D).
7. Haga una incisión a través de todo el tejido entre el mesencéfalo y el encéfalo posterior y separe el encéfalo posterior, incluido el cerebelo (Figura 1E).
8. Extirpar todo el cerebelo haciendo incisiones a lo largo del tejido en ambas uniones laterales del cerebelo y la placa alar del cerebro posterior, teniendo cuidado de mantener la integridad de la pia durante toda la disección (Figura 1F). Además, extirpe el plexo coroideo en formación (Figura 1G).
9. Mueva el cerebelo diseccionado a la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) helada.

>2. Cultivo en rodajas de cerebelo e14

1. Transfiera todo el cerebelo a la plataforma estéril de un picador de tejidos con una espátula o una pipeta Pasteur de 3 ml con la punta cortada para ampliar la abertura. Retire el exceso de líquido con una pipeta.
2. Corte todo el cerebelo entero en la orientación requerida a 300 μm de espesor utilizando el juego de picadoras de tejidos con una velocidad de corte del 50% del máximo. La integridad del tejido se conserva más fácilmente en la sección sagital; sin embargo, la orientación también es una consideración importante para el análisis celular (las dendritas de las células de Purkinje están alineadas sagitalmente, mientras que los axones de las células granulosas corren transversalmente, perpendiculares al plano de las dendritas de las células de Purkinje).
3. Con una pipeta Pasteur de 3 ml, cubra el cerebelo en rodajas con HBSS helado.
4. Transfiera las rodajas en HBSS a una placa de Petri de 60 mm que contenga HBSS fresco y helado con una pipeta Pasteur de 3 ml con punta cortada.
5. Bajo un microscopio de disección iluminado con una fuente de luz de fibra óptica, asegúrese de separar las rodajas individuales con pinzas de relojero.
   nota: Cada disección, desde el embrión hasta la incubación en un medio de cultivo, dura entre 10 y 20 minutos, dependiendo de la experiencia. Realice disecciones una a la vez para asegurarse de que el cerebelo pase la mínima cantidad de tiempo entre la decapitación y el cultivo ex vivo.

Figura 1. Disección del cerebelo a partir de embriones de pollo E14. (A) Decapitar al polluelo en el huevo y quitar la cabeza en una placa de Petri con PBS helado. Extirpe la mandíbula inferior y los ojos haciendo una incisión detrás de los ojos y la faringe (línea discontinua). (B) Retire la piel de la superficie del cráneo. (C) Extirpar los huesos frontal y parietal, y (D) separar el cerebro del mesénquima y el cartílago que lo rodea. (E) Bajo un microscopio de disección, identifique la ubicación del cerebelo en el extremo posterior del cerebro. Corte entre el mesencéfalo y el encéfalo posterior (líneas discontinuas) para dejarlo con el cerebelo y el desencéfalo posterior ventral. (F) Haga incisiones en las uniones laterales (pedúnculos) del cerebelo para separar el cerebelo del cerebro posterior (línea discontinua). (G) Retire el plexo coroideo (asterisco) del lado ventral del cerebelo hasta que quede con un cerebelo intacto completo con la pia adherida. Transfiera el cerebelo a HBSS helado antes de preparar las rodajas con una picadora de pañuelos.