Establecimiento de cultivos primarios de células gliales mixtas a partir de la médula espinal de un ratón

Resumen

Fuente: Malon, J. T., et al. Preparación de cultivos gliales mixtos primarios a partir de tejido de médula espinal de ratón adulto. J. Vis. Exp. (2016).

Este video muestra una técnica para aislar y cultivar células gliales mixtas primarias de tejido de la médula espinal de ratón adulto. El protocolo implica la digestión enzimática del tejido, seguida de la eliminación de las membranas celulares rotas y los restos de mielina para obtener una población de una sola célula. A continuación, las células se cultivan en medios optimizados para el crecimiento de células gliales mixtas.

Protocolo

1. Preparación de soluciones en una campana de cultivo en condiciones asépticas

1. Preparar el medio de cultivo: completar la modificación de Dulbecco del medio de Eagle (cDMEM) que contiene DMEM (con 4,5 g/L de glucosa), 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 UI/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina, 250 ng/mL de anfotericina B y 50 μM de 2-mercaptoetanol (2-ME; véase 1.1.1). Mezcle y filtre, esterilice todos los demás componentes y luego agregue FBS. Almacene el medio de cultivo a 4 ^°C.
   1. Prepare 50 mM de solución madre salina 2-ME/tamponada con fosfato (PBS): añadir 100 μL de 2-ME concentrado (14,3 M) en 28,6 mL de 1x PBS y esterilizar con filtro (la solución puede almacenarse a 4 ^°C durante varios meses). Utilice 1 mL de solución madre 2-ME por cada 1.000 mL de medios de cultivo.
2. Preparación de los medios de gradiente de densidad
   1. Prepare una solución de medios de gradiente de densidad isotónica (p. ej., 100% Percoll) a partir de 1 parte de PBS estéril regular 10x y 9 partes de medios de gradiente de densidad de stock estériles (p. ej., Percoll).
   2. Diluya el medio de gradiente de densidad del 100% (hecho en 1.2.1) con PBS estéril regular 1x para hacer un medio de gradiente de densidad del 20% (por ejemplo, 10 mL de medio de gradiente de densidad 100% con 40 mL de PBS 1x) y guárdelo a 4 ^°C. Lleve el medio de gradiente de densidad del 20% a temperatura ambiente (RT) antes de preparar el cultivo celular.
3. Preparación de soluciones a partir del sistema de disociación de papaína
   NOTA: El sistema de disociación de la papaína se puede identificar en la Tabla de Materiales. También se pueden utilizar otros kits de disociación similares (incluidos los ensamblados internamente). Todos los componentes deben ser estériles.
   1. Agregue 32 mL de solución salina equilibrada de Earle's (EBSS) a la mezcla de inhibidores de ovomucoides (polvo).
   2. Agregue 5 mL de EBSS a un vial de papaína (polvo). Coloque el vial de papaína en un baño de agua a 37 ^°C durante 10 minutos o hasta que la papaína se disuelva.
   3. Añadir 500 μL de EBSS a un vial de DNasa (polvo). Mezclar suavemente.
   4. Agregue 250 μL de la solución de DNasa (arriba) al vial de papaína.
   5. Calcule la cantidad total de la mezcla de papaína/DNasa mencionada anteriormente (aproximadamente 800 μL de mezcla de papaína/DNasa por médula espinal de ratón) y transfiera la mezcla necesaria a un tubo de 50 mL para la digestión de los tejidos. Guarde el sobrante en el vial original a 4 °C durante al menos dos semanas.
   6. Mantenga todos los componentes de los kits en hielo hasta que los necesite.
4. Prepare tubos de recolección de la médula espinal: un tubo estéril de 15 mL con 5 mL de solución salina balanceada de Hank (HBSS; del sistema de disociación de papaína, para recolectar la médula espinal) y un tubo estéril de 15 mL con 1x PBS (para llenar la jeringa de 5 mL). Además, prepare una placa de Petri estéril (35 mm o 60 mm) con 5 mL de HBSS y manténgala en la campana de cultivo.

>2. Preparación de la suspensión unicelular

>Nota: Realice los pasos 3 y 4 en una campana de cultivo para mantener todo estéril.

1. Transfiera toda la médula espinal a la placa de Petri que contiene HBSS. Corta cada una de las médula espinal en muchos pedazos finos y pequeños con tijeras y pinzas estériles. Transfiera el tejido de la médula espinal al tubo cónico de 50 mL que contiene la mezcla enzimática de papaína/DNasa preparada (paso 1.3.5) utilizando pinzas estériles o una pipeta de 10 mL (evite agregar HBSS a la mezcla de enzimas, ya que esto diluirá aún más la solución enzimática preparada y puede resultar en una disminución del rendimiento de la enzima).
2. Agite el tubo suavemente para mezclar. Incubar el tubo a 37 ^oC durante 1 h en una incubadora/agitadora con agitación orbital a 150 rpm.
3. Vuelva a agitar el tubo y triture vigorosamente la solución enzimática con el tejido utilizando una pipeta de 5 ml para promover una mayor disociación.
4. Transfiera la suspensión de la celda a un tubo de 15 ml y centrifugue a 300 x g durante 5 min en RT.
5. Durante la centrifugación, mezclar 2,7 mL de EBSS con 300 μL de solución de inhibidor de la albúmina y ovomucoide reconstituido (1.3.1) en un tubo estéril. Añadir 150 μL de la solución de DNasa (paso 1.3.3).
6. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con la solución preparada anteriormente (paso 1.5). Pozo de vórtice para romper la célula de pellets.
7. Añadir 3 mL de solución de inhibidor de la albúmina-ovomucoide reconstituido (paso 1.4.1) a la suspensión celular. Centrifugar las células a 70 x g durante 6 min en RT. Eliminar el sobrenadante (que contiene fragmentos de membrana).

>3. Eliminación adicional de mielina de la suspensión unicelular

1. Añada 8 mL de medio de gradiente de densidad del 20% (preparado en el paso 1.2.2) en el tubo que contiene el pellet de celda, haga un vórtice suavemente para romper el pellet y centrifugue las celdas a 800 x g durante 30 min a RT sin frenar. Retire con cuidado la capa superior de residuos (principalmente mielina) y el sobrenadante, pero conserve la bolita.
2. Para eliminar los restos del gradiente de densidad, lave las células volviendo a suspender el pellet de celda con 8 mL de un cDMEM diluido (1 parte de cDMEM y 2 partes de HBSS). Centrifugar las células a 400 x g durante 10 min a 4 ^oC. Retirar el sobrenadante y lavar de nuevo las células con el cDMEM diluido (arriba) de la misma manera. Mantenga las células en hielo hasta sembrarlas.
3. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en un medio de cultivo (cDMEM suministrado con 2-ME (preparado en el paso 1.1)). Para una placa de 12 pocillos, use 3 mL x 4 (número de ratones utilizados) + 2 mL = 14 mL de medio. Esto asegurará que haya suficiente suspensión celular para toda la placa (12 pocillos) y proporcionará pocillos adicionales que se pueden usar para determinar el número promedio de células por pocillo y el contenido microglial del cultivo. Si se van a utilizar otros tipos de recipientes de cultivo, calcule proporcionalmente el volumen total de medios de cultivo necesarios.
4. Agregue 1 mL de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de 12 pocillos.
5. Incubar las células a 35,9 ^oC con 5% de CO₂.
6. Cambie el medio (elimine el medio antiguo por aspiración) en D 1 y luego cada 3 a 4 días a partir de entonces (normalmente cambie el medio en D: 1, 4, 8 y 11, y luego use las celdas en el día 12).
   nota: El día 1, el cultivo puede contener cantidades significativas de residuos debido al residuo de mielina del tejido de la médula espinal; Por lo tanto, se recomienda cambiar los medios el día 1. Los cultivos están listos para el tratamiento entre los 12 y los 14 años. Por lo general, las células tienen un 80% de confluentez en D 12 y pueden estar cerca del 100% de confluentes en D 14. Típicamente, en D 12, hay alrededor de 100.000 células por pocillo en una placa de 12 pocillos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Modificación de Dulbecco de los medios de Eagle (DMEM) con 4,5 g/L de glucosa	Lonza	12-709F	El medio cDMEM es un medio de cultivo estándar y ampliamente utilizado. Los investigadores individuales pueden decidir dónde comprar el DMEM y todos los demás componentes utilizados para fabricar los medios cDMEM.
L-Glutamina (100x)	Lonza	17-605E	La L-glutamina es un componente estándar y ampliamente utilizado para diversos medios de cultivo. Los investigadores individuales pueden decidir dónde comprar L-glutamina.
Solución antibiótica-antimicótica (100x)	Corning-Mediatech	30-004-CI	Se trata de una combinación de penicilina, estreptomicina y anfotericina formulada para contener 10.000 unidades/mL de penicilina G, 10 mg/mL de sulfato de estreptomicina y 25 μg/mL de anfotericina B. Los investigadores individuales pueden decidir dónde comprar componentes individuales.
2-mercaptoetanol (2-ME)	Sigma-Aldrich	M3148	Un biorreactivo, adecuado para cultivo celular, biología molecular y electroforesis.
Sistema de disociación de la papaína	Corporación Bioquímica de Worthington	LK003150	Los componentes individuales de este kit se pueden comprar por separado.
Percoll	Cuidado de la salud de GE	17-0891-01	Percoll se vende como solución estéril. Percoll sin diluir se puede volver a esterilizar en autoclave si es necesario.
Incubadora/agitadora de línea de laboratorio	Barstead/Línea de laboratorio	MaxQ4000	Esta es la incubadora/agitadora que tenemos actualmente. En su lugar, se pueden utilizar otros tipos de agitadores.