Diferenciación de células progenitoras óticas en células epiteliales sensoriales seguidas de inmunotinción

Resumen

Fuente: Azadeh, J. et al., Iniciando la diferenciación en células progenitoras óticas multipotentes inmortalizadas.J. Vis. Exp. (2016).

Este video demuestra la diferenciación de células progenitoras óticas multipotentes inmortalizadas (iMOP) en células epiteliales sensoriales. Describe los pasos involucrados en el cultivo de células iMOP, la formación de otosferas, la inducción de la diferenciación y la visualización de los componentes celulares y los marcadores de diferenciación a través de la microscopía de fluorescencia para confirmar la diferenciación celular exitosa.

Protocolo

1. Mantener la autorrenovación en las células IMOP

1. Preparar los medios de cultivo iMOP: DMEM/F12, suplemento 1X B27, 25 μg/ml de carbenicilina y 20 ng/ml de factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF). Prepare 50 ml de medio de cultivo iMOP con reactivos estériles. Calentar 49 ml de DMEM/F12 en un recipiente cónico de 50 ml en un baño de agua a 37 °C.
   1. Descongele el suplemento 50X B27 y las alícuotas de carbenicilina de 100 mg/ml esterilizadas con filtro durante 5 min en un baño de agua a 37 °C. Descongele 100 μg/ml de alícuota de bFGF en RT. Agregue 1 ml de 50X B27, 10 μl de 100 μg/ml de bFGF y 12,5 μl de 100 mg/ml de carbenicilina en DMEM/F12.
2. Utilice 3 ml de medio en una placa de cultivo de tejidos de 60 mm para cultivar células iMOP. Agregue medios nuevos a las culturas cada dos días duplicando el volumen de medios. Asegúrese de que la concentración de bFGF no caiga por debajo de 5 ng/ml.
   1. Cultivo de células iMOP a 37 °C con 5% de CO_2. Pase las células en cultivo después de 5 a 7 días como se indica en los pasos a continuación. Transfiera el cultivo a una cónica de 15 ml con una punta de pipeta de 10 ml.
3. Produzca 1 mM de EDTA en HBSS diluyendo 0,1 ml de 0,5 M de EDTA pH 8,0 en 50 ml de HBSS. Precalentamiento de 1 mM de EDTA fabricado en HBSS en un baño de agua a 37 °C.
4. Recolección de células por gravedad, sedimentación o centrifugación a 200 x g durante 5 min en RT. Para la sedimentación por gravedad, coloque el cónico de 15 ml que contiene los cultivos en la incubadora a 37 °C durante 5 a 10 min. Pasado ese tiempo, observe las otosferas recogidas en el fondo del cónico de 15 ml.
   nota: Una fuerza centrífuga excesiva puede causar daños en las células.
5. Aspire cuidadosamente los medios gastados con una pipeta de aspiración de 2 ml sin alterar el pellet de la célula. Añada 0,5 ml de solución precalentada de 1 mM EDTA HBSS al pellet de celda. Con una pipeta P1000, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo 2 o 3 veces. Colocar la cónica a 37 °C e incubar durante <5 min para facilitar la disociación en células individuales.
6. Agite suavemente la solución celular para determinar si las otosferas están disociadas. Si ninguna otosfera se sedimenta en el fondo del cónico, las células se disocian. El tiempo de incubación puede variar.
   nota: La incubación prolongada con EDTA provocará una muerte celular excesiva.
7. Retire las células de 37 °C, agregue 2 ml de medio para neutralizar y diluya el EDTA. Recoja las células por centrifugación a 200 x g durante 5 min en RT. Aspire el EDTA diluido con una pipeta de aspiración de 2 ml y añada 5 ml de PBS 1X para lavar las células.
8. Gire las células a 200 x g durante 5 min en RT y aspire 1X PBS con una pipeta de aspiración de 2 ml. Vuelva a suspender las células con una pipeta P1000 en 0,5 ml de medio de cultivo iMOP pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 2 o 3 veces.
9. Cuente las células utilizando un contador de partículas microfluídicas con los casetes adecuados. Una placa confluente de celdas iMOP contendrá ~6 X10⁶ celdas. Diluya las células 1:100 en el medio y añada 75 μl de solución celular en el casete para el recuento. Placa 1 x 10⁶ células en una placa de 6 cm en medio de cultivo iMOP (dilución ~1:10). Paso de iMOPs cada 5 - 7 días.
   nota: Las células que forman grandes otosferas o se adhieren al fondo de la placa de cultivo de tejidos se diferenciarán. Las células también morirán si los cultivos son sobreconfluentes.

>2. Diferenciación de células IMOP en epitelios sensoriales

1. Preparar 50 ml de medios de diferenciación de epitelios sensoriales iMOP: DMEM/F12, 1X suplemento de B27, 25 μg/ml de carbenicilina. Prepare 50 ml de medios de diferenciación de epitelios sensoriales iMOP. Calentar 49 ml de DMEM/F12 en un recipiente cónico de 50 ml en un baño de agua a 37 °C. Descongele el suplemento 50X B27 y 100 mg/ml de alícuotas de carbenicilina durante 5 min. en un baño de agua a 37 °C. Añadir 1 ml de 50X B27 y 12,5 μl de 100 mg/ml de carbenicilina en el DMEM/F12.
2. Para recolectar, disociar, resuspender y contar células, repita los pasos 1.4-1.9
3. Placa de 1 x 10⁶ celdas en una placa de 6 cm en el día -3 utilizando medios de cultivo iMOP. El día 0, transfiera los cultivos con una pipeta de 10 ml a una cónica de 15 ml. Recoja las otosferas por sedimentación por gravedad, como se indica en el paso 1.6. Aspire los medios gastados con una pipeta de aspiración de 2 ml y deje las otosferas en la parte inferior del cónico.
4. Añadir suavemente 2 ml de medios de diferenciación de epitelios sensoriales. Transfiera las otosferas a un plato de 6 cm con una pipeta de 10 ml de diámetro grande.
   nota: El cizallamiento mecánico del pipeteo brusco puede disociar las células de las otosferas.
5. Añadir 2 ml de medios de diferenciación epitelial sensorial frescos a los cultivos cada dos días. Si es necesario, las células se pueden recolectar por sedimentación por gravedad y se pueden reemplazar los medios.
6. Recoja las otosferas en el día 10 transfiriéndolas a una cónica de 15 ml y permitiendo que las otosferas se sedimenten como se indica en el paso 1.6. Aspire los medios gastados con una pipeta de aspiración de 2 ml y deje las otosferas intactas.
7. Fije las otosferas incubando en formaldehído al 4% en 1X PBS durante 15 min en RT. Retire la solución de formaldehído y lave las otosferas con tampón de lavado (1X PBS que contiene 0.1% TritonX-100) antes de incubarlas en tampón de bloqueo (1X PBS que contiene 10% de suero de cabra normal y 0.1% Triton X-100) durante 1 hora.
   1. Reemplace el tampón e incube las muestras en el tampón de bloqueo con anticuerpo diluido. Incubar a 4 °C. Lavar las muestras con 1X PBS que contenga 0,1% de Triton X-100 y someter la osfera a inmunotinción. Transfiera las otosferas a 1X PBS y colóquelas en medios de montaje en un portaobjetos de vidrio con una pipeta P1000. Coloque un cubreobjetos sobre la muestra y deje que el material de montaje se seque a 4 °C.
8. Adquiera imágenes de epifluorescencia utilizando una configuración de microscopio invertido equipada con una cámara CCD de 16 bits y un objetivo de inmersión en aceite de 20X 0,75 aire o 40X 1,3 NA. Recoja la fluorescencia de diferentes canales de color utilizando las longitudes de onda enumeradas (excitación y emisión): azul (377 ± 25 nm/447 ± 30 nm), verde (475 ± 25 nm/540 ± 25 nm), rojo (562 ± 20 nm/ y 625 ± 20 nm) e infrarrojo (628 ± 20 nm/ y 692 ± 20 nm).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cubreobjetos de vidrio de 1,5 mm de espesor (redondo 12 mm)	Ciencias de la Microscopía Electrónica	72230-01
DMEM/F12	Tecnologías de la Vida	11320-082
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7.4	Tecnologías de la Vida	10010-023
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)	Tecnologías de la Vida	14025-092
Suplemento B27 (50X) Sin Suero	Tecnologías de la Vida	17504-044	Almacenado como alícuotas de 1 ml
Prolongar el oro Montaje antidecoloración	Tecnologías de la Vida	47743-736	Almacenado como 10 mg/ml 100 μl alícuotas
Contador de celdas automatizado Moxi Z Mini	Orflo	MXZ001
Cassette Moxi Z tipo S	Orflo	MXC002
Factor de crecimiento de fibroblastos murinos recombinante, básico (bFGF)	Peprotech	450-33	Resuspendido en BSA al 0,1% en H20 y almacenado como alícuotas de 20 mg/ml
Carbenicillina, Sal Disódica	Thermo Fisher Scientific	BP2648-1	Resuspendido en hepes de 10 mM pH 7,4 y almacenado como alícuotas de 100 mg/ml
5 ml pipeta envuelta individualmente en rústica (200/caja)	Thermo Fisher Scientific	1367811D
Pipeta de 10 ml envuelta individualmente en rústica (200/caja)	Thermo Fisher Scientific	1367811E
Plato de cultivo de tejidos tratado de 6 cm	Thermo Fisher Scientific	130181
Puntas de pipeta de filtro TipOne 0,1-10 ul punta de filtro alargada	Científico de EE. UU	1120-3810
Puntas de pipeta de filtro TipOne Punta de filtro de 1-20 ul	Científico de EE. UU	1120-1810
Puntas de pipeta de filtro TipOne Punta de filtro de 1-200 ul	Científico de EE. UU	Teléfono: 1120-8810
Puntas de pipeta de filtro TipOne 101-1000 ul punta de filtro	Científico de EE. UU	Llame al 1126-7810
Tubos cónicos de 15 ml estériles 20 bolsas de 25 tubos (500 tubos)	Científico de EE. UU	1475-0511
50 ml tubos cónicos estériles 20 bolsas de 25 tubos (500 tubos)	Científico de EE. UU	1500-1211

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