Diferenciación de progenitores óticos multipotentes inmortalizados en neuronas ganglionares espirales y evaluación de la diferenciación

Resumen

Fuente: Azadeh, J., et al. Iniciando la diferenciación en células progenitoras óticas multipotentes inmortalizadas. J. Vis. Exp. (2016).

El video demuestra la diferenciación de progenitores óticos multipotentes inmortalizados (iMOPs) en neuronas ganglionares espirales (SGNs) y la confirmación de la diferenciación basada en inmunofluorescencia. Los iMOPs se colocan en cubreobjetos recubiertos de sustrato de cultivo en un medio de diferenciación neuronal para su diferenciación en SGN. Las células diferenciadas se marcan con anticuerpos específicos para los marcadores de diferenciación neuronal y se analizan al microscopio para confirmar la diferenciación.

Protocolo

1. Diferenciación de neuronas derivadas de iMOP

1. Prepare 50 ml de medios de diferenciación neuronal: Medios neurobasales, 1X suplemento de B27, 2 mM de L-Glutamina. Descongele la botella de 50X B27 y 200 mM de L-Glutamina en un baño de agua a 37 °C durante 5 min. Añadir 1 ml de 50X B27 y 0,5 ml de L-glutamina 200 mM a 48,5 ml de medio Neurobasal.
2. Cubra el cubreobjetos colocando cubreobjetos redondos de 1,5 mm de 12 mm en una placa estéril de 10 cm y agregue etanol (EtOH) al 70% a la placa para esterilizar y limpiar los cubreobjetos.
3. Agite suavemente los cubreobjetos para asegurarse de que estén cubiertos de etanol. Deje la placa durante 10 minutos en RT. Enjuague los cubreobjetos 3 veces con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) 1X para lavar el etanol restante. Enjuague el cubreobjetos una vez con H₂O estéril para lavar el 1X PBS restante.
4. Aspire el H₂O con una pipeta de aspiración de 2 ml y deje secar los cubreobjetos. Exponga los cubreobjetos a la luz ultravioleta en la campana de cultivo de tejidos durante 15 minutos. Guarde los cubreobjetos en un ambiente estéril si no se usan inmediatamente.
5. Coloque un cubreobjetos redondo de 12 mm en cada pocillo de un plato de 24 pocillos. Agite el plato suavemente para asegurarse de que los cubreobjetos queden planos en el fondo del pozo.
6. Descongele 2 mg/ml de solución madre de poli-D-lisina a temperatura ambiente (RT) y diluya hasta una concentración de 10 μg/ml de poli-D-lisina en 1X PBS. Añadir 0,25 ml de poli-D-lisina de 10 ug/ml a los pocillos. Deje la placa en la incubadora a 37 °C durante 1 hora.
7. Lave los pocillos 3 veces con PBS estéril 1X. Descongele 10 mg/ml de solución madre de laminina en RT y diluya a 10 μg/ml en 1X PBS. Añadir 0,25 ml de 10 μg/ml de solución de trabajo de laminina en un solo pocillo de un plato de 24 pocillos múltiples. Incubar la placa a 37 °C de la incubadora. Aspire la solución de laminina con una pipeta de aspiración de 2 ml.
8. Lave el cubreobjetos 3 veces con 1X PBS añadiendo 1 ml de 1X PBS con una pipeta P1000 y retirando el 1X PBS aspirando con una pipeta de aspiración de 2 ml. Deje 1X PBS del último lavado en el pocillo hasta que las celdas estén listas para ser plateadas. Iniciar la diferenciación neuronal mediante la recolección, disociación y recuento de células. Plato 1 x 10⁶ celdas en un plato de 6 cm en el día -3.
9. En el día 0, cosecha, disocia y cuenta las células. Siembre 1 x 10⁵ - 1,5 x 10^{5 células} iMOP en un medio de diferenciación neuronal precalentado de 0,5 ml por pocillo en una placa de 24 pocillos múltiples. Aspire y agregue medios de diferenciación neuronal precalentados a los cultivos cada dos días.
10. Fije las neuronas derivadas de iMOP en formaldehído al 4% durante 15 min. en RT el día 7. Retire la solución de formaldehído, lave las neuronas derivadas de iMOP con tampón de lavado (1X PBS que contiene 0,1% de TritonX-100) antes de incubar en tampón de bloqueo (1X PBS que contiene 10% de suero de cabra normal y 0,1% de Triton X-100) durante 1 hora.
    1. Reemplace el tampón e incube las muestras en el tampón de bloqueo con anticuerpo diluido. Incubar a 4 °C. Lavar las muestras con 1X PBS que contengan un 0,1% de células sometidas de Triton X-100 a inmunotinción. Lave el cubreobjetos con 1X PBS antes de colocarlo en el soporte de montaje. Deje que el medio de montaje se seque a 4 °C antes de obtener imágenes de epifluorescencia.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cubreobjetos de vidrio de 1,5 mm de espesor (redondo 12 mm)	Ciencias de la Microscopía Electrónica 7	72230-01
DMEM/F12	Tecnologías de la Vida	11320-082
Medio Neurobasal	Tecnologías de la Vida	21103
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7.4	Tecnologías de la Vida	10010-023
Suplemento B27 (50X) Sin Suero	Tecnologías de la Vida	17504-044	Almacenado como alícuotas de 1 ml
L-glutamina (200 mM)	Tecnologías de la Vida	25030-081	Almacenado en alícuotas de 5 ml
Laminina de ratón natural	Tecnologías de la Vida	23017-015	Almacenado como alícuotas de 1 mg/ml
Prolongar el oro Montaje antidecoloración	Tecnologías de la Vida	47743-736	Almacenado como 10 mg/ml 100 μl alícuotas
Contador de celdas automatizado Moxi Z Mini	Orflo	MXZ001
Cassette Moxi Z tipo S	Orflo	MXC002
Poli-D-lisina	sigma	Página 7886	Resuspendido en 1X PBS y almacenado como alícuotas de 10 mg/ml 100 μl
5 ml pipeta envuelta individualmente en rústica (200/caja)	Thermo Fisher Scientific	1367811D
Pipeta de 10 ml envuelta individualmente en rústica (200/caja)	Thermo Fisher Scientific	1367811E
Placa de 24 pocillos Biolite tratada para cultivo de tejidos	Thermo Fisher Scientific	130188
Placa de 6 pocillos Biolite tratada con cultivo de tejidos	Thermo Fisher Scientific	130184
Plato de cultivo de tejidos tratado de 6 cm	Thermo Fisher Scientific	130181
EMD Millipore Millex Jeringa estéril PVDF Filtro Tamaño de poro: 0,22 μm	Thermo Fisher Scientific	SLGV033RS
Puntas de pipeta de filtro TipOne 0,1 - 10 μl punta de filtro alargada	Científico de EE. UU	1120-3810
Puntas de pipeta de filtro TipOne 1 - 20 μl de punta de filtro	Científico de EE. UU	1120-1810
Puntas de pipeta de filtro One 1 - 200 μl de punta de filtro	Científico de EE. UU	Teléfono: 1120-8810
Puntas de pipeta de filtro TipOne 101 - 1000 μl Punta de filtro	Científico de EE. UU	Llame al 1126-7810
Tubos cónicos de 15 ml estériles 20 bolsas de 25 tubos (500 tubos)	Científico de EE. UU	1475-0511
50 ml tubos cónicos estériles 20 bolsas de 25 tubos (500 tubos)	Científico de EE. UU	1500-1211