Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Preparación de instrumentos, soluciones y medios
>Nota: Toda la información sobre materiales, reactivos, herramientas e instrumentos reportados en el protocolo se especifican en la Tabla de Materiales.
- Esterilizar en autoclave todos los instrumentos de disección y guardarlos en un área estéril. Utilice los siguientes instrumentos: 4 pinzas estándar (2 largas y 2 cortas) y 2 tijeras, así como 2 pinzas (1 larga y 1 corta) y 1 tijera para la disección; Guarde un juego adicional como copia de seguridad.
- Prepare 100 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS)/suero fetal bovino (FBS) al 1% para usar durante los lavados, los procedimientos de inmunoetiquetado y las etapas de clasificación de células. Mantenga la solución refrigerada a 4 °C.
nota: No agregue azida de sodio (NaN3) a la solución, ya que puede ser tóxica para las células vivas.
- Prepare 100 mL de PBS/1% FBS con 99 mL de PBS y 1 mL de FBS.
- Prepare 100 mL de medio de células neurales estériles suplementado con 3% de FBS (ver Tabla de Materiales) para su uso como medio de recolección y cultivo. Mantener estéril el medio de cultivo celular a 4 °C. Solo caliéntelo a temperatura ambiente (RT) antes de usarlo.
- Prepare 100 mL de medio de células neurales suplementado con 3% de FBS utilizando 97 mL de medio de células neuronales y 3 mL de FBS.
- Preenfriar los tubos de recolección (tubos de 15 mL) prerrecubiertos con 5 mL de medio de recolección colocándolos en una cubitera. Utilice únicamente tubos de polipropileno para evitar que las células se adhieran a la superficie del tubo.
- Coloque platos de 40 mm, coladores de nailon de 70 μm, jeringas, morteros para el filtro de células y tubos estériles de polipropileno en el gabinete de bioseguridad. Esterilice todos los artículos antes de los procedimientos y manténgalos de manera estéril durante todos los procedimientos.
nota: Todos los pasos posteriores a la recolección de la retina se realizarán en el gabinete de bioseguridad.
2. Preparación de la suspensión de células de la retina
- Coloque el ojo recolectado en la placa base de un microscopio de disección para comenzar la disección corneal. Disecciona cada ojo individualmente.
- Sostenga con cuidado el globo en la base del nervio óptico con pinzas. Para este paso, use una pinza estándar larga y otra corta.
- Use una aguja afilada de calibre 30 (30 G) para perforar la córnea. Esto permitirá que el humor acuoso se evacue del ojo, lo que facilitará la sujeción del ojo con las pinzas.
- Sostenga la córnea con las pinzas y use unas tijeras para hacer una pequeña incisión en la córnea. Pegue suavemente la córnea y la esclerótica con las pinzas. Cuando el globo esté despegado hasta la mitad, extraiga la retina y el cristalino con las pinzas. Deseche la córnea, la esclerótica y el cristalino.
nota: Este método asegura que la retina se separe completamente del resto del ojo.
- Coloque la retina en una pequeña placa de Petri de 40 mm que contenga PBS/1% FBS.
nota: Como alternativa a la placa de Petri, se puede utilizar una placa de cultivo celular. Asegúrate de mantener siempre la retina húmeda, como en las condiciones fisiológicas.
- Lave cada retina tres veces con PBS estéril fresco/FBS al 1% dentro de la cabina de bioseguridad.
- Coloque hasta 12 retinae en un colador estéril de nailon de 70 μm humedecido con PBS/1% FBS. Con el extremo posterior de una jeringa de 10 ml, macere suavemente la retina con un movimiento circular para separar las células.
- Alternativamente, use un mortero para la maceración del colador celular o use la digestión enzimática con una combinación de 15 UI/mL de papaína, 5 mM de L-cisteína y 200 U/mL de DNasa I durante 15 min a 37 °C, seguida de inactivación con PBS/10% FBS.
nota: No se observaron cambios en el porcentaje de células recuperadas cuando se comparó la digestión enzimática con la maceración con el extremo posterior de la jeringa o el mortero.
- Para transferir las células aisladas, coloque el colador de nailon estéril de 70 μm sobre el tubo de recolección de polipropileno. Pase las células recogidas a través del colador con una pipeta P1000. Enjuague el colador (paso 3.6) con PBS/FBS al 1% para liberar las células restantes y transferirlas al tubo de recolección.
- Añadir PBS/1% FBS para conseguir un volumen final de 1 mL por retina. Centrifugar la suspensión de la célula durante 7 min a 200 x g y RT.
Nota: Dependiendo del número de retinas maceradas (< 6 retinas), la cápsula celular puede ser demasiado pequeña para ser visible.
- Deseche el sobrenadante celular y vuelva a suspender el pellet celular en PBS/FBS al 1% utilizando una proporción de 1 mL por 5 retinae.
- Cuente las células con un hemocitómetro.
- Limpie un hemocitómetro de vidrio y cubra el cubreobjetos con alcohol al 70%. Agite suavemente el tubo que contiene las células para asegurarse de que la suspensión de células de la retina se distribuya uniformemente. Colocar 20 μL de azul de tripano al 0,4% en un tubo de microcentrífuga y mezclar con 20 μL de la suspensión celular.
- Mezcle suavemente y aplique 10 μL de la mezcla de suspensión de 0,4% de azul de tripano/célula en el hemocitómetro, llenando ambas cámaras; la acción capilar arrastrará la mezcla de suspensión de azul de tripano/célula al 0,4% debajo del cubreobjetos. Con un microscopio, cuente todas las células negativas de azul tripano; Este número representa las células vivas.
- Determine la viabilidad celular utilizando la siguiente fórmula: recuento de células vivas / recuento total de células = % de viabilidad.
nota: Si la viabilidad de las células es inferior al 95%, se requiere un colorante fluorescente para discriminar la viabilidad celular durante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
- Use un tinte fluorescente de viabilidad que no sea permeable para las células vivas. Lavar las células con PBS para eliminar cualquier rastro de suero. Agregue 1 μL de colorante fluorescente para discriminar la viabilidad celular por cada 5,0 x 106 células en un volumen final de 100 μL. Incubar en RT durante 15 min, protegido de la luz. Agregue 10 veces el volumen de PBS/1% FBS. Centrífuga durante 5 min a 200 x g y RT.
- Si es necesario, incubar la suspensión celular durante la noche a 4 °C. Si se hace esto, llene el tubo de suspensión celular con medio de célula neural en lugar de PBS/FBS al 1%. Coloque el tubo horizontalmente y manténgalo a 4 °C.
3. Inmunomarcaje de las células de la retina
- Utilice la siguiente conversión para determinar el volumen de anticuerpo por número de células: 2 μL de anticuerpo por 5,0 x 106 células en un volumen de 100 μL.
- Lave las celdas y manténgalas en PBS/1% FBS. Tome una pequeña alícuota de celdas (5.0 x 106 celdas) para usarla como control negativo (sin etiquetar) en el momento de la configuración de la clasificación.
nota: Este control negativo es crítico para la correcta calibración del clasificador de células.
- Para minimizar la unión inespecífica de los anticuerpos a las células que expresan los receptores Fcγ II y III, se añada 1 μL de un anticuerpo anti-ratón CD16/32 por cada 1,0 x 106 células en un volumen final de 50 μL utilizando PBS/FBS al 1%. Incubar durante 10 min en RT.
- Agregue el cóctel de anticuerpos a la muestra y mezcle suavemente mediante pipeteo. Incubar durante 30 minutos en una cubitera. Asegúrese de que la cubitera esté cubierta, ya que la luz podría comprometer el experimento debido al fotoblanqueo de los fluoróforos marcados.
- Prepare el cóctel de anticuerpos utilizando los siguientes anticuerpos anti-ratón marcados con fluorescencia: CD90.2 AF (Alexa fluor)-700, CD48 PE (ficoeritrina)-cianina7, CD15 PE y CD57.
sin marcar
Nota: Para cada anticuerpo, utilice las siguientes concentraciones por 5,0 x 106 células: CD90,2 AF700, 1 μg; CD48 PE-cianinina7, 0,4 μg; CD15 PE, 0,02 μg; y CD57 sin marcar, 0,4 μg.
- Utilice los volúmenes según los siguientes cálculos (basados en los anticuerpos disponibles comercialmente enumerados en la Tabla de materiales): total de 5,0 x 107 células para marcar; 2 μL por 5,0 x 106 células = 20 μL de cada anticuerpo; 4 anticuerpos diferentes = 80 μL de cóctel de anticuerpos; volumen final = [(5,0 x 107 células en total)/5,0 x 106 células] x 100 = 1.000 μL; 80 μL de Abs + 50 μL de CD16/32 anti-ratón + 870 μL de PBS/1% FBS = 1.000 μL.
nota: Esta combinación proporcionó la combinación óptima de fluorocromos para la configuración del instrumento. Los siguientes parámetros resumen la emisión y la excitación: AF-700, emisión de 719 nm cuando se excita con un láser de diodo rojo de 638 nm; PE-Cyanine7, emisión de 767 nm cuando se excita con un láser de diodo azul de 488 nm; y PE, emisión de 575 nm cuando se excita con un láser de diodo azul de 488 nm.
- Después de la incubación de 30 minutos, aumente el volumen hasta 5 ml con PBS/FBS al 1%. Lave las muestras centrifugandolas durante 7 min a 200 x g y RT. Repita el procedimiento una vez para eliminar todos los anticuerpos no unidos.
- Agregue 2 μL de anticuerpo secundario (0,1 μg), que se unirá al CD57 de 5,0 x 106 células. Incubar durante 30 minutos en una cubitera, como en el paso 3.4. Lave las células dos veces, como en el paso 3.5.
- Etiquete las células con un anticuerpo secundario si se utilizó un anticuerpo primario no marcado en el paso 3.4.
Nota: El anticuerpo secundario de elección para esta configuración se enumera en la Tabla de materiales; Tiene una longitud de onda de emisión de 421 nm. Úselo con un filtro de paso de banda de 450/50 nm cuando se excite con el láser de diodo violeta a 405 nm.
- Utilice volúmenes según los siguientes cálculos (basados en el anticuerpo disponible comercialmente que figura en la Tabla de materiales): 2 μL por 5,0 x 106 células = 20 μL de anticuerpo secundario; volumen final = [(5,0 x 107 células totales)/5,0 x 106 células] x 50 = 500 μL; 20 μL de Abs + 480 μL de PBS/1% FBS = 500 μL.
- Mantenga las celdas marcadas en PBS/1% FBS. Cuente las células con un hemocitómetro; utilizar una concentración final de células retinianas de 3,0 - 4,0 x 107 células/mL.
nota: No utilice el medio de cultivo celular para diluir las células porque el rojo de fenol puede aumentar la autofluorescencia, reduciendo así la resolución entre células negativas y positivas. La concentración final de la celda por volumen depende en gran medida del caudal volumétrico de la configuración del instrumento.
- Utilice controles de un solo color durante la configuración para minimizar el desbordamiento de fluorescencia.
nota: Este paso, también conocido como compensación, se aplica para corregir el ruido creado por la combinación de fluoróforos. Las microesferas de poliestireno en PBS/0,1% BSA/2 mM NaN3 con la capacidad de unirse a isotipos de inmunoglobulina (Ig) marcados con fluorescencia de múltiples especies proporcionan controles positivos para establecer la compensación.
- Coloque 3 gotas de las microesferas de poliestireno en tubos FACS estériles, asignando una por fluoróforo. Añada 1 μg del fluoróforo respectivo a cada tubo. Incubar durante 15 min en RT, protegido de la luz. Agregue 3 mL de PBS/1% FBS a los tubos de muestra. Centrifugar durante 5 min a 200 x g y RT. Retirar con cuidado el sobrenadante y volver a suspender en 250 μL de PBS/FBS al 1%.
- Para configurar los controles negativos, utilice microesferas de poliestireno que no se unan al Ig. Si es necesario, realice este paso el día anterior.