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Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
>NOTA: Brevemente, los fibroblastos fueron reprogramados a iPSC a través de la reprogramación genética basada en ARNm. Las iPSC se mantuvieron en medio de células madre (SCM) (ver lista de materiales) y se almacenaron a una densidad de ~1,2 x 102 células/mL con 1 mL de SCM, 10 μM con inhibidor de proteína quinasa asociado a rho (ROCKi) Y-27632 y 10% (v/v) de sulfuro de dimetilo (DMSO), en viales criopreservados en nitrógeno líquido a -160 °C. Todos los siguientes procedimientos se llevan a cabo en una cabina de bioseguridad, a menos que se indique lo contrario.
1. Dilución de la matriz de la membrana basal y recubrimiento de la placa
- Matriz de membrana basal reducida con factor de crecimiento diluido (1:50) purificada a partir de un tumor Engelbreth-Holm-Swarm en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sin rojo de fenol.
- Cubra las placas de cultivo celular con la cantidad adecuada de matriz de membrana basal diluida (es decir, placa de 6 pocillos = 1 ml, placa de 12 pocillos = 0,5 ml) e incube estas placas a 37 °C durante al menos 1 hora.
>2. Mantenimiento de células madre pluripotentes inducidas (iPSC)
NOTA: La confluencia máxima por pocillo en una placa de fondo plano de 6 pocillos es de ~1,2 x 106 celdas.
- Descongele las iPSC criopreservadas en SCM con 10 μM Y-27632 y póngalas en una placa de 6 pocillos recubierta con una matriz de membrana basal reducida en factor de crecimiento diluido.
- Mantenga las iPSC en SCM con 10 μM Y-27632 durante las primeras 24 horas después de la descongelación. Cambie a medio fresco después de 24 horas.
- Mantenga las iPSC en SCM hasta que las células alcancen el 80-90% de confluencia antes de pasar.
- Calcule cuántas iPSC se necesitarán para la diferenciación multiplicando la densidad deseada para la diferenciación (15.600 células/cm2) por el área superficial del pozo. Para una placa de fondo plano de 6 pocillos, multiplique 15.600 células/cm2 por 9,6cm2 para un total de 149.760 células/pocillo.
- Para pasar, lave las células con la solución salina equilibrada (HBBS) de Hanks. A continuación, incubar las células con ácido etilendiaminotetraacético no enzimático (EDTA) (ver lista de materiales) durante 5 minutos a 37 °C.
- Use un raspador de células para levantar suavemente las células. Recoja las células en SCM fresco.
- Coloque las células en placas de cultivo celular recubiertas con SCM diluido y mantenga las células como se describe en el paso 2.3 o almacénelas a ~1,2 x 106 células/mL en 1 mL de SCM, 10 μM Y-27632 y 10% DMSO (v/v) en viales criopreservados en nitrógeno líquido a una temperatura de -160 °C.
>3. Diferenciación de iPSCs a BMECs
NOTA: El EDTA no enzimático separa las células en grupos. El EDTA enzimático (ver Tabla de Materiales) separa las células en suspensión de una sola célula. El ácido retinoico (AR) debe protegerse de la luz.
- Lave las iPSC una vez con la solución salina tampón de fosfato (DPBS) de Dulbecco. Incubar con EDTA enzimático (1 mL para la placa de 6 pocillos, 0,5 mL para la placa de 12 pocillos y 0,25 mL para la placa de 24 pocillos) durante aproximadamente 5 minutos a 37 °C para producir una suspensión de una sola célula.
- Recoja las celdas y centrifugue a 300 x g (fuerza centrífuga relativa) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Resuspenda los gránulos de celda en SCM que contengan 10 μM Y-27632.
- Determine la densidad celular usando Trypan Blue y un contador de células automatizado o un dispositivo hemocitómetro. Células de placa a una densidad de 15.600 células/cm2 o 149.760 células/pocillo de una placa de fondo plano de 6 pocillos (con una superficie de 9,6 cm2/pocillo) en SCM que contiene 10 μM Y-27632 durante 24 horas.
- Inicie la diferenciación después de 24 horas cambiando SCM a medio E6. Cambie el medio E6 diariamente durante los próximos 4 días.
- En el día 4 de diferenciación, reemplace el medio E6 con medio libre de suero endotelial humano (hESFM) suplementado con suplemento de B27 diluido (1:200), 20 ng/mL de factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) y 10 μM de AR. No cambie este medio durante las próximas 48 horas.
- Prepare 200 mL de hESFM con B27 diluido (1:200), mezcle 1 mL de suplemento de B27 concentrado 50x con 199 mL de hESFM.
- Prepare 20 ng/mL de bFGF reconstituyendo 50 μg de bFGF en 250 μL de tampón Tris (5 mM de Tris, pH 7,6, 150 mM de cloruro de sodio, NaCl) para hacer 200 μg/mL de solución madre. Prepare 200 mL de hESFM que contengan 20 ng/mL de bFGF mezclando 20 μL de 200 μg/mL de bFGF con 200 mL de hESFM.
- Prepare 10 μM de AR haciendo primero una solución madre de 40 mg/mL de AR añadiendo 2,5 mL de DMSO a 100 mg de polvo de AR. Diluya esta concentración a 3 mg/mL para hacer una solución madre de 10 mM. Prepare 200 mL de hESFM que contengan 10 μM de RA mezclando 200 μL de 10 μM de RA en 200 mL de hESFM.
>4. Recubrimiento de la matriz de colágeno IV (COL4) y fibronectina (FN) para la purificación de BMEC derivadas de iPSC
- Agregue 2 mL de agua estéril a 2 mg de FN para hacer 1 mg/mL de solución madre de FN. Agregue 5 mL de agua estéril a 5 mg de COL4 para hacer una solución madre de COL4 de 1 mg/mL.
- Deje que FN se disuelva durante al menos 30 minutos a 37 °C y que el COL4 se disuelva a temperatura ambiente.
- Diluir la solución madre de FN en agua estéril hasta una concentración final de 100 μg/mL y la solución madre de COL4 hasta una concentración final de 400 μg/mL.
- Cubra las placas deseadas (placa de 6 pocillos = 1 mL de solución COL4/FN, placa de 12 pocillos = 0,5 mL, placa de 24 pocillos = 0,25 mL y placa filtrada de 12 pocillos trans = 0,25 mL) con la mezcla de 400 μg/mL de COL4 y 100 μg/mL de FN.
- Incubar las placas durante un mínimo de 2 horas o toda la noche a 37 °C; para las placas filtradas Transwell, se recomienda un mínimo de 4 horas.
>5. Subcultivo y purificación de BMECs derivadas de iPSC
NOTA: La incubación con EDTA enzimático puede tardar más de 15 minutos dependiendo de la confluencia de las células en el día 6 de diferenciación.
- En el día 6 de diferenciación, lavar las células dos veces con DPBS. Incubar con 1 mL de EDTA enzimático durante al menos 15 minutos a 37 °C hasta obtener una suspensión unicelular.
- Recoja las células por centrifugación a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender los gránulos celulares con hESFM fresco con suplemento de B27 diluido (1:200), 20 ng/mL de bFGF y 10 μM de AR.
- Células de siembra en placas recubiertas con una mezcla de 400 μg/mL de COL4 y 100 μg/mL de FN. Células de siembra utilizando una proporción de 1 pocillo de una placa de 6 pocillos por 3 pocillos de una placa de 12 pocillos, 3 pocillos de una placa filtrada de 12 pocillos o 6 pocillos de una placa de 24 pocillos.