$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Configuración del material
- Incubar los huevos de pollito en una incubadora de huevos de mesa disponible en el mercado a 37 °C. Incubar los huevos durante 7 días para los embriones E7.
- Preparar matrices de electrodos múltiples (MEA). Esterilice el número requerido de MEAs sumergiéndolos en etanol al 70% durante 3 a 4 h y luego enjuagándolos tres veces en aproximadamente 10 mL de agua destilada estéril en la campana de nivel de bioseguridad II (BSLII).
nota: Los MEAs contienen 64 electrodos de platino nanoporosos dispuestos en una rejilla de 8 x 8. El diámetro del electrodo es de 30 μm y el espacio entre los electrodos es de 200 μm. No utilice etanol desnaturalizado para esterilizar los MEA, ya que esto provocará corrosión.
- Coloque los MEA dentro de un recipiente estéril con tapa (para mantener las condiciones estériles) y muévalos a una incubadora de mesa. Hornee durante al menos 6 horas a 55 °C. Este paso es fundamental para una esterilización adecuada y la temperatura no debe superar los 60 °C. Para mantener la esterilidad, mueva el plato que contiene MEA a la campana BSLII para guardarlo hasta su uso posterior.
nota: Utilizamos una fuente para hornear de vidrio apta para horno con tapa y superficie de plástico, la esterilizamos con etanol al 70% y la colocamos en la campana BSLII para su secado.
- Alícuota de la solución de matriz extracelular (MEC). Descongele el vial a 4 °C durante la noche y congele 100 μL de alícuotas a -20 °C.
nota: ECM se envía congelado. No debe llevarse a temperatura ambiente hasta que esté listo para recubrir, ya que polimeriza a temperatura ambiente y es imposible recubrir una vez polimerizado. Se prefiere la ECM sin factores de crecimiento para evitar efectos adicionales debido a factores desconocidos.
- Esterilice todos los instrumentos de disección (pinzas Dumont #5, pinzas curvas, tijeras pequeñas y tijeras de resorte) y los platos de disección recubiertos de material autosellante con etanol al 70% y déjelos secar en la campana de disección.
>2. Cultivo de neuronas embrionarias de pollito y actividad de red
- El día del enchapado, saque un vial de ECM del congelador a -20 °C, rocíe con etanol al 70% y colóquelo sobre hielo. Diluir al 25% añadiendo 300 μL de medio neurobasal frío dentro de la campana BSLII.
- Con una pipeta P200, agregue 100 μL de ECM al 25% en el centro del MEA, teniendo cuidado de no tocar los electrodos y retírelos inmediatamente, dejando una película delgada en la superficie. Cubra el MEA y colóquelo en la incubadora de CO2 (37 ° C y 5% de CO2) hasta que esté listo para colocar las neuronas.
- Esterilizar la cáscara exterior de un huevo E7 (embrionario día 7, incubado a 37 °C durante 7 días) con etanol al 70%. Decapitar el embrión en una placa de disección de fondo Sylgard que contiene una solución fría y estéril de sales balanceadas de Hank (HBSS) sin calcio. Corta alrededor de los ojos y retira los globos oculares. Con pinzas finas DuMont #5 y tijeras de resorte, haga una incisión en el lado ventral y retire las capas externas de la piel para exponer el prosencéfalo y el tectum óptico. Pelar y retirar la membrana pial con cuidado. Transfiera el prosensencerebro a otra placa de Petri y córtelo en trozos pequeños de unos 2 mm con unas tijeras de resorte.
nota: No debe haber ningún vaso sanguíneo unido al prosencéfalo después de la extirpación de la membrana pial. Si se dispone de ella, es preferible realizar la disección en una campana de disección estéril, aunque hemos obtenido resultados bastante buenos cuando la disección se realiza fuera de una campana siempre que los instrumentos y el área de disección estén completamente esterilizados con etanol al 70%.
- Con una pipeta de transferencia estéril, recoja los trozos de prosencéfalo en un tubo de centrífuga de 15 ml y elimine la mayor cantidad posible de HBSS después de dejar que se hundan hasta el fondo del tubo de centrífuga.
- Añadir 1 mL de tripsina/ácido etilendiamérico tetraacético al 0,05% (tripsina/EDTA) (precalentado a 37 °C) e incubar a 37 °C durante 15 minutos.
- Con una pipeta Pasteur, retire con cuidado la tripsina sin alterar los trozos de tejido y añada 1 mL de medio neurobasal. Deje que los trozos de papel se hundan hasta el fondo y retire el medio. Repite este lavado una vez más. Este paso es para lavar la tripsina/EDTA.
- Agregue 2 mL de medio neurobasal y comience a triturar. La trituración consiste en tomar una pipeta Pasteur estéril pulida al fuego y pasar suavemente el tejido a través de ella varias veces hasta que no se vean más piezas. Si quedan piezas después de pasadas repetidas, simplemente déjelas reposar en el fondo.
nota: Evite espumar mientras tritura: si se forma espuma, deténgase y retírela por aspiración.
- Diluir las células resuspendidas 1:10 con medio neurobasal y contar las células viables utilizando un colorante azul de tripano y un hemocitómetro. Mezcle 50 μL de las células diluidas con 50 μL de solución de Trypan Blue en un tubo de centrífuga de 0,5 mL. Agregue 10 μL al hemacitómetro después de colocarlo en el cubreobjetos y cuente las celdas claras brillantes (las celdas azules están muertas y no deben contarse).
nota: Los números de células típicos de un solo tectum óptico E7 oscilan entre 1 y 5 x 107 células/mL.
- Coloque las células disociadas en MEA recubiertos de ECM a una densidad de 2.200 células/mm cuadrado. Para nuestro sistema MEA, esto se traduce en aproximadamente 130.000 células por MEA. Agregue el medio neurobasal para llevar el volumen en el MEA a 1 mL y coloque los MEA en la incubadora de CO2 durante la noche para la unión celular y la extensión de la neurita (Figura 1).
nota: Para MEAs de diferentes áreas y números de electrodos, se podrían probar diferentes densidades de celdas: en general, una mayor densidad de celdas da como resultado una mayor actividad de la red, pero también conduce a cultivos de vida más corta.
