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>1. Generación de células progenitoras neurales derivadas de iPSC (iNPCs)
- Produzca esferas EZ a partir de colonias de iPSC como se describe a continuación y como se publicó anteriormente.
- Cultivo de colonias de iPSC hasta la confluencia en placas de 6 pocillos recubiertas de matriz de membrana basal (0,5 mg/placa) en mTESR1 u otros medios comerciales (ver Tabla de Materiales).
- Retire el medio iPSC y reemplácelo con 2 mL de medio EZ-sphere [ESM; DMEM:F12 7:3 suplementado con 100 ng/mL de factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF), 100 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico, 5 μg/mL de heparina y 2% de suplemento de B27].
- Raspe el fondo de cada pocillo confluente con el dorso de una punta de pipeta estéril de 1000 μL o un raspador de células.
- Recoja todas las células y colóquelas en un matraz T25 de fijación ultra baja para permitir la formación espontánea de esferas que flotan libremente. Incubar durante la noche a 37 °C.
- Alimente las esferas cada 2 o 3 días cuando el medio se vuelva amarillo reemplazando la mitad del medio con ESM fresco. Esto permite que las esferas permanezcan en un medio acondicionado, lo cual es muy importante para su crecimiento y mantenimiento.
- Apoye el matraz en una rejilla de tubos y deje que las esferas se asienten por gravedad durante 1-2 minutos hasta la esquina del matraz.
- Una vez sedimentado, aspire la mitad del sobrenadante con una pipeta serológica de 5 mL o 10 mL y reemplácela con ESM fresca y precalentada.
- Pase las esferas EZ semanalmente cortando esferas de 200 μm de diámetro como se ha descrito anteriormente. Las esferas EZ se pueden mantener hasta 25 pasajes y son ideales cuando se usan entre los pasajes 8 y 25.
- Prepare la suspensión de una sola celda de iNPC:
- Para inducir la diferenciación neuronal, disocie la esfera EZ en células individuales.
- Recoja las esferas 3-4 días después del corte de un matraz T75 y transfiéralas a un recipiente cónico de 15 ml, luego déjelo reposar durante 2 minutos o hasta que todas las esferas se asienten en el fondo.
- Retire lentamente el ESM con una pipeta de 5 ml sin alterar las esferas asentadas. Añadir 1 mL de solución de disociación (ver Tabla de Materiales) e incubar durante 10 min a 37 °C.
- Agite la solución de disociación y las esferas después de 5 minutos de incubación para asegurarse de que se traten las esferas sedimentadas.
- Retire lentamente la solución de disociación. Añadir 1 mL de medio de diferenciación neuronal [NDM; DMEM: F12 con 2% de B27 menos vitamina A, suplemento de N2 al 1% y factor neurotrófico derivado del cerebro humano (hBDNF, 20 ng/mL)].
- Triturar las esferas en células individuales pipeteando con una pipeta de 1 mL seguida de una pipeta de 200 μL, hasta que todas las esferas se hayan disociado. Evite la formación de burbujas durante el procedimiento de trituración.
- Cuente las células disociadas con un hemocitómetro y diluya las células hasta una densidad final de 1 x 106 células/mL. Es posible cambiar la densidad dependiendo de la aplicación.
nota: Se recomiendan densidades más altas (hasta 6 x 106 células/mL) para cultivos a corto plazo de hasta 3 días, y densidades más bajas para aplicaciones a largo plazo de hasta 3 semanas><.
nota: Las células ahora están listas para sembrarse en el canal superior del chip para formar el "lado del cerebro".
>2. Diferenciación de iPSCs en iBMECs
- Paso de iPSC desde un solo pozo confluente de una placa de 6 pocillos en una proporción de 1:6 a una placa recubierta de matriz de membrana basal de 6 pocillos. Deje que las células se adhieran durante 24 h. Cambie el medio iPSC a diario.
- Cuente las células diariamente con un hemocitómetro.
- Cuando las células alcancen una densidad de 1,5-3,0 x 105 células/pocillo, sustituya el medio iPSC por 3 ml de medio incondicionado sin bFGF [DMEM:F12 1:1, con un 10 % de reemplazo de suero knockout (KOSR), un 1 % de aminoácidos no esenciales (NEAA), un suplemento de glutamina al 0,5 % (Tabla de materiales) y 100 μM de β-mercaptoetanol]. Reemplace el medio diariamente durante 6 días.
- En el día 6, reemplace el medio con medio de células endoteliales (EC) [medio libre de suero endotelial humano (hESFM) suplementado con suero bovino derivado de plasma pobre en plaquetas al 1%, 20 ng/mL de bFGF y 10 μM de ácido retinoico (AR) todo-trans]. Dejar medio durante 2 días.
- Retire el medio EC y agregue 1 mL de solución de disociación por pocillo. Incubar a 37 °C durante 35 min.
nota: Si bien esto se considera un tiempo de incubación prolongado en la solución de disociación utilizada aquí, los iBMEC pueden soportar este tratamiento con una viabilidad celular superior al 90%.
- Separe las células del pocillo pipeteando suavemente la suspensión celular y recogiendo todas las células en un tubo cónico de 15 mL.
nota: Evite el pipeteo brusco. Si las células no se desprenden fácilmente, incube durante 5 minutos más.
- Agregue 1 volumen de medio EC al cónico de 15 mL para inactivar Accutase, centrifugue a 200 x g durante 5 min, retire el medio y reemplácelo con 1 mL de medio EC (sin bFGF y AR).
- Cuente las células con un hemocitómetro y ajuste la densidad de células a 14–20 x 106 células/mL.
nota: Las células ahora están listas para ser sembradas en el canal inferior del chip para formar el "lado de la sangre".
>3. Microfabricación del chip del órgano
- Utilice un chip de órgano para el modelo de chip BBB y su producción como se hizo anteriormente. El chip de órgano de canal alto (ver Tabla de Materiales) se fabrica a partir de un elastómero de polidimetilsiloxano (PDMS) altamente flexible que contiene dos canales a microescala superpuestos y paralelos separados por una membrana porosa flexible. Los tamaños de microcanal superior e inferior son 1 mm x 1 mm y 1,0 mm x 0,2 mm, respectivamente. Los dos canales están separados por una membrana porosa flexible de 50 μm de espesor hecha de PDMS, que contiene poros de 7 μm de diámetro con un espaciado de 40 μm. La superficie de la membrana porosa que separa los canales es de 0,171cm2.
>4. Preparación de virutas
- Los chips de órgano se suministran preempaquetados dentro del portador de chips, lo que elimina la necesidad de alterar o distorsionar la alineación del chip durante la manipulación. Además, el portador de chips se conecta de forma segura a un módulo portátil ("Pod") que actúa como interfaz entre el módulo de cultivo y el chip.
- Rocíe el empaque de las astillas con etanol al 70% y llévelas a la cabina de bioseguridad (BSC).
- Abra el empaque y coloque el chip del órgano en una placa de Petri estéril. Manipule el portador de virutas solo por los lados para evitar el contacto directo con el chip.
- Asegúrese de que la lengüeta del portador esté orientada hacia la derecha (Figura 1) y, cuando utilice varios chips, alinéelos todos en la misma orientación.
- Etiquete cada chip en la pestaña del portador (la preparación completa del chip y el flujo de trabajo se muestran en la Figura 2).
5. Activación de superficies y recubrimiento ECM
- Preparación de la solución de activación de superficies
- El reactivo Emulate 1 (ER-1), suministrado en un vial que contiene 5 mg, es sensible a la luz. Prepare la solución ER-1 fresca inmediatamente antes de usarla. La integridad del ER-1 es crucial para el éxito de la preparación de los chips.
- Apague la luz en el BSC cuando manipule ER-1.
nota: ER-1 es un irritante ocular y debe manipularse en el BSC con guantes y protección ocular adecuados.
- Deje que los reactivos ER-1 y ER-2 se equilibren a temperatura ambiente (RT) antes de su uso.
- Proteja la solución de la luz envolviendo un tubo cónico estéril vacío de 15 ml con papel de aluminio.
- En el BSC, golpee brevemente el vial ER-1 para asentar el polvo en la parte inferior.
- Agregue 1 mL de tampón ER-2 al vial e inmediatamente transfiera su contenido al fondo del tubo cónico envuelto de 15 mL. No pipetear para mezclar. El color de la solución transferida al tubo cónico será rojo.
- Repita el paso 5.1.6 3 veces. En la última ronda, tape el vial ER-1 e inviértalo para recoger el polvo restante de la tapa, luego transfiera la solución al tubo cónico; esto elevará el volumen total a 4 mL de solución ER-1.
- Añadir 6 mL de solución de ER-2 a los 4 mL de solución de ER-1 en el tubo cónico de 15 mL hasta una concentración final de 0,5 mg/mL. ER-1 debe estar completamente disuelto dentro de la solución ER-2.
- Activación de superficie
- Utilizando una pipeta P200 y una punta de pipeta filtrada estéril de 200 μL, tome 200 μL de la mezcla ER-1.
- Coloque la pipeta en la entrada inferior y empuje 20 μL de la mezcla ER-1 a través del canal inferior hasta que la mezcla comience a fluir por la salida del canal inferior.
- Agregue aproximadamente 50 μL de mezcla ER-1 y colóquela en la entrada del canal superior. Empuje la mezcla a través del canal superior hasta que comience a fluir por la salida del canal superior.
- Retire todo el exceso de mezcla ER-1 de la superficie del chip mediante una aspiración suave. Asegúrese de que la mezcla ER-1 solo se elimine de la superficie de la viruta y no de los canales.
- Verifique que los canales estén libres de burbujas de aire antes de la activación de la radiación ultravioleta (UV). Si se detectan burbujas de aire, elimine las burbujas lavando el canal con la mezcla ER-1.
- Coloque el plato abierto que contiene las papas fritas en la caja de luz ultravioleta (proporcionada por Emulate Inc.).
- Coloque el interruptor en la parte posterior de la caja de luz ultravioleta en la configuración "Consistente". Encienda la alimentación e inicie la activación UV. Deje las patatas fritas bajo luz ultravioleta durante 20 min.
nota: Evite la exposición del personal a la luz ultravioleta.
- Retire la mezcla ER-1 de ambos canales.
- Lave cada canal con 200 μL de solución ER-2.
- Retire ER-2 de ambos canales.
- Lave cada canal con 200 μL de solución salina estéril fría tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS).
- Deje DPBS fríos dentro de los canales hasta continuar con el siguiente paso.
- Preparación y recubrimiento de la matriz extracelular (MEC)
- Prepare la solución de ECM combinando los componentes individuales de ECM con DPBS frío, agua u otro solvente hasta las concentraciones finales de trabajo. La solución ECM debe prepararse fresca cada vez que se utilice.
- Cubra los canales superior e inferior del chip con ECM, con la composición determinada por el tipo de celda que se va a sembrar. La mezcla de ECM debe mantenerse en hielo hasta su uso.
- Utilice laminina (50 μg/mL) para recubrir el "lado del cerebro", y colágeno IV y fibronectina mezclados en una proporción de 4:1 (320:80 μg/mL) para recubrir el "lado de la sangre" como se describe en la sección 5.6.
- Preparación de alícuotas de ECM
- Diluir 1 mg/mL de laminina en DPBS frío hasta una concentración final de 50 μg/mL. Alícuota y almacenar a -20 °C hasta su uso.
- Disuelva el colágeno IV en ácido acético al 0,1% a una concentración de 1 mg/mL. Incubar la solución a 2-8 °C durante la noche o a RT durante 1-3 h o hasta que se disuelva por completo.
- Prepare una mezcla de 1 mL de colágeno IV:fibronectina (320 μL de colágeno IV, 80 μL de fibronectina, 600 μL de H2O estéril de doble destilación). La mezcla se puede almacenar a -20 °C.
- Recubrimiento de las virutas con ECM
- Aspire completamente el DPBS frío desde ambos canales. Configure una pipeta P200 para que absorba 100 μL de solución de colágeno IV:fibronectina.
- Introduzca la solución a través de la entrada del canal inferior hasta que se forme una pequeña gota en la salida. Deje una pequeña gota en la entrada después de retirar la punta de la pipeta.
- Introduzca la solución de laminina a través de la entrada del canal superior hasta que se forme una pequeña gota en la salida. Deje una pequeña gota en la entrada después de retirar la punta de la pipeta.
- Mire de cerca los canales para asegurarse de que no haya burbujas. Si hay burbujas, lave el canal con la solución ECM adecuada hasta que se eliminen todas las burbujas.
- Repita los pasos 5.5.1 a 5.5.4 para cada chip.
- Agregue 1,5 mL de DPBS a la tapa de un tubo cónico de 15 mL. Coloque la tapa DPBS en la placa de cultivo de 150 mm con las virutas para proporcionar humedad adicional y selle la placa con parafilm. Para obtener los mejores resultados, incube las fichas a 4 °C durante la noche.
nota: Si se desea, las células se pueden sembrar el mismo día que la activación del chip y el recubrimiento de ECM, aunque se prefiere la incubación durante la noche. Las virutas pueden estar listas para la siembra 4 h después de añadir el ECM e incubar las virutas a 37 °C.
>6. Sembrando el canal del "lado del cerebro" y diferenciando esferas EZ en cultivos neuronales mixtos
- Lleve el plato que contiene las papas fritas preparadas al BSC. Lavar suavemente ambos canales con 200 μL de NDM.
- Evitando el contacto con los puertos, aspire con cuidado el exceso de gotas de medios de la superficie del chip. Agite suavemente la suspensión celular antes de sembrar cada chip para asegurar una suspensión celular homogénea
- Sembrando los iNPCs en el canal superior para generar el "lado del cerebro"
- Siembre las células (1 x 106 células/mL) en el canal superior del chip. Añada una punta P200 que contenga 30-100 μL de suspensión celular a la entrada del canal superior y suelte suavemente la punta de la pipeta. Tome una pipeta P200 vacía, presione el émbolo, insértelo en la salida del canal superior y tire con cuidado de la suspensión de una sola celda a través del chip.
- Cubra el plato y transfiéralo al microscopio para verificar la densidad de siembra y la distribución homogénea de las células dentro del canal superior. Retire con cuidado la punta de la pipeta de los puertos de entrada y salida del chip.
- La densidad de siembra debe aparecer como una cobertura del 20%. Si la densidad de siembra es mayor o menor de lo esperado o desigual, devuelva las fichas al BSC, lave el canal 2 veces con 200 μL de medio fresco y repita el paso 6.3.1.
- Después de confirmar la densidad celular correcta, coloque inmediatamente las fichas en la incubadora durante 2 h a 37 °C después de sembrar cada lote de fichas. Lave las celdas que no se adhieren con NDM fresco.
- Mantenga las celdas en condiciones estáticas a 37 °C con un reemplazo diario de NDM durante al menos 48 h antes de iniciar el flujo. Los iBMEC se pueden sembrar después de que los iNPC se hayan adjuntado o al día siguiente de la siembra de iNPC.
>7. Sembrando iBMECs en el canal inferior para generar el "lado de la sangre"
- Lleve el plato que contiene las papas fritas preparadas al BSC. Lave suavemente el canal inferior con 200 μL de medio EC.
- Evitando el contacto con los puertos, aspire con cuidado las gotas de exceso de medio EC de la superficie del chip, asegurándose de dejar medio en ambos canales. Agite suavemente la suspensión celular antes de sembrar cada chip para asegurar una suspensión celular homogénea.
- Con una pipeta P200, extraiga 30-100 μL de la suspensión de células iBMEC (14-20 x 106 células/mL) y coloque la punta en la entrada del canal inferior. Desconecte suavemente la punta de la pipeta, dejando la punta que contiene la célula en el puerto de entrada.
- Pise el émbolo de una pipeta P200 con la punta vacía, insértelo en la salida del canal inferior y tire con cuidado de la suspensión de célula única a través del canal inferior soltando lentamente el émbolo de la pipeta.
- Aspire el exceso de suspensión celular de la superficie del chip. Evite el contacto directo con los puertos de entrada y salida para asegurarse de que no se aspire ninguna suspensión de celdas fuera de los canales.
- Cubra el chip y transfiéralo al microscopio para observar la densidad de siembra. El canal inferior debe llenarse sin espacios observables entre las células cuando se observa a 4x o 10x bajo un microscopio (Figura 3).
- Si la densidad de siembra está por debajo del 90% de cobertura o está distribuida de manera desigual, ajuste la densidad de celdas en consecuencia y repita los pasos 7.2-7.6 hasta que se logre la densidad correcta dentro del canal. Después de confirmar la densidad de celdas correcta (Figura 3), siembre las células en los chips restantes. Para unir las células a la membrana porosa, que se encuentra en la parte superior del canal inferior, invierta cada chip y descanse en una cuna para chips.
- Coloque un pequeño depósito (tapón de tubo cónico de 15 mL que contenga DPBS estéril) dentro del plato de 150 mm para proporcionar humedad a las células. Incube las virutas a 37 °C durante aproximadamente 3 h, o hasta que las células del canal inferior se hayan adherido. Una vez que los iBMEC se hayan conectado (~ 3 h después de la siembra), voltee los chips a una posición vertical para permitir la conexión de la celda a la parte inferior del canal inferior.
>8. Inicio del flujo
- Por lo general, el flujo se inicia 48 h después de la siembra de iBMEC. Este tiempo es necesario para que los iBMEC se adhieran firmemente al chip.
- Para mantener el flujo laminar a través del chip, es importante desgasificar y equilibrar la temperatura del medio. El medio debe precalentarse en un baño de agua a 37 °C durante 1 h.
- Se pueden desgasificar hasta 50 ml de medio calentado mediante incubación bajo un sistema de filtración accionado por vacío durante 15 minutos.
- Cebado de módulos portátiles
- Desinfecte el exterior del embalaje y las bandejas del módulo portátil con etanol al 70%, limpie y transfiera al BSC. Abra el paquete y coloque los módulos en la bandeja. Oriéntelos con los depósitos hacia la parte posterior de la bandeja.
- Pipetee 3 mL de medio caliente preequilibrado en cada depósito de entrada. Agregue el medio de cultivo EC al depósito de entrada del canal inferior y el NDM al depósito de entrada del canal superior del canal superior (Figura 4).
- Pipetee 300 μL de medio caliente preequilibrado en cada depósito de salida, directamente sobre cada puerto de salida (Figura 4).
- Coloque hasta seis módulos portátiles en cada bandeja. Lleve las bandejas a la incubadora y deslícelas completamente en el módulo de cultivo con el asa de la bandeja hacia afuera.
- Seleccione y ejecute el ciclo "Prime" en el módulo de cultura. Cierre la puerta de la incubadora y permita que el módulo de cultivo cebe los módulos portátiles (tarda ~ 1 min). El ciclo de cebado se completa cuando en la barra de estado se lee "Listo". Retire la bandeja del módulo de cultivo y llévela al BSC.
- Verifique que los módulos portátiles se hayan cebado correctamente inspeccionando la parte inferior de cada módulo portátil en el BSC. Busque la presencia de pequeñas gotas en los cuatro puertos.
- Si algún módulo portátil no muestra gotas, vuelva a ejecutar el ciclo principal en esos módulos. Si algún medio goteó sobre la bandeja (esto puede ocurrir con más frecuencia por los puertos de salida), limpie la bandeja con etanol al 70%.
- Conexión de chips a módulos portátiles, regulación e inicio del flujo
- Lave suavemente ambos canales de cada chip con un medio de cultivo específico de células tibio y equilibrado para eliminar cualquier posible burbuja en el canal y coloque pequeñas gotas de medio (de acuerdo con el medio en el canal) en la parte superior de cada puerto de entrada y salida.
- Inserte chips con portadores en los módulos portátiles y coloque hasta seis en cada bandeja. Inserte las bandejas en el módulo de cultivo. Programe las condiciones apropiadas de cultivo de chips de órgano (caudal y estiramiento) en el módulo de cultivo.
- Las condiciones programadas comenzarán tan pronto como se complete el ciclo "Regular><".
nota: Los caudales de cada canal se pueden controlar de forma independiente y se pueden ajustar a tasas que oscilan entre 0 y 1.000 μL/h. El chip BBB se cultiva normalmente a 30 μL/h. Cuando fluyen medios como medios EC o ESM a 30 μL/h y 1000 μL/h, las fuerzas de cizallamiento son de 0,01 dyn/cm2 y 0,33 dyn/cm2, respectivamente.
- Ejecute el ciclo "Regular", que dura aproximadamente 2 h, después de lo cual el módulo de cultivo comenzará a fluir en las condiciones de cultivo de chips de órganos preestablecidas.
