Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de la rebanada de cerebro
- Utilice ratones machos C57BL/6J, de 4 a 8 semanas de edad. Aloje a los animales en una habitación con aire acondicionado (21-23 °C; 50% de humedad; ciclo de luz/oscuridad de 12 horas/12 horas, las luces se encienden a las 8:00 a.m.) con acceso gratuito a comida y agua.
- Tome una alícuota de 250 ml del líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) y colóquela en un vaso de precipitados que contenga hielo. Al mismo tiempo, suministre gas continuo que esté compuesto por un 95% deO2 y un 5% de CO2.
- cirugía
- Anestesiar al animal con isoflurano al 4% en una caja de vidrio durante aproximadamente 3 min. Una vez que el animal alcance una profundidad quirúrgica de anestesia (indicada por la falta de respuesta al pinzamiento del dedo del pie), colóquelo en una bandeja poco profunda que esté llena de hielo picado y retire la cabeza con unas tijeras.
- Exponga el cráneo y recorte el músculo restante. A continuación, con rongeurs, retire la superficie dorsal del cráneo del cerebro. Recorta los lados del cráneo con rongeurs. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos con una solución de etanol al 75%.
- Con una espátula, corte los bulbos olfativos y las conexiones nerviosas a lo largo de la superficie ventral del cerebro y extraiga el cerebro. Después de la decapitación, transfiera rápidamente el cerebro a un vaso de precipitados lleno de aCSF oxigenado helado.
- Preparación del corte cerebral del tálamo medial (MT)-corteza cingulada anterior (ACC)
nota: Prepare segmentos que contengan la ruta desde el MT hasta el ACC.
- Cortar a mano el bloque cerebral con dos cortes sagitales de 2,0 mm laterales a la línea media en cada hemisferio para mostrar la anatomía subcortical. A continuación, haz dos cortes en ángulo. Realice el primer corte transversal paralelo al tracto de fibras visible en el cuerpo estriado.
- Realice el segundo corte transversal desde la conexión entre el cerebelo y la corteza visual hasta el punto medio entre la comisura anterior y el tracto óptico que son ventrales y paralelos a la vía talamocingulada.
- Fije el bloque cerebral a una placa angular (~ 120 °) con adhesivo de cianoacrilato y haga un corte justo por encima del punto de inflexión de la vía. Despliega la placa, aplánala y pégala en la etapa de la cámara de un vibrátomo.
- Haga cortes de cerebro del tálamo-ACC medial (500 μm de grosor) y luego sumérjalos en aCSF oxigenado helado. Transfiera los cortes a la cámara de registro y manténgalos a 32 °C en perfusión continua (12 ml/min) con aCSF oxigenado durante 1 hora.
