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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Microdisección telencéfalo dorsolateral
- Prepare el medio de disección (100 mL): 98,5 mL de solución salina equilibrada de Hank (HBSS), 0,5 mL 5 M Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES) pH 7,4, 1 mL de penicilina/estreptomicina (10.000 unidades/mL y 10.000 μg/mL).
- Filtrar-esterilizar el medio de disección.
- Extracción de embriones de día 14 (E14) de una ratón embarazada C57/Bl6 (Mus musculus) bajo anestesia con isoflurano.
nota: Considere E0 como el día de la detección del tapón vaginal. La disección debe completarse a más tardar 1 h después de la extracción de la rata preñada. Este protocolo también se aplica a los embriones E11-E17.
- Extraer los embriones mediante histerectomía en condiciones estériles.
- Transfiera los embriones a una placa de Petri con un medio de disección frío (4 °C).
- Extrae los sesos del cráneo cortando a lo largo de la fisura longitudinal. El número de embriones suele variar de cinco a diez. Cada cerebro E14 produce aproximadamente 2 x 106 células, incluidos los progenitores y las neuronas postmitóticas (proporción 1:1)
nota: Utilice el microscopio estereoscópico para los siguientes pasos.
- Retire las meninges con pinzas de disección. Divide el telencéfalo por la mitad para separar los hemisferios. Para aislar el telencéfalo dorsolateral, corte a lo largo de la curva dorsomedial y el límite palial-subpalial con pinzas de disección. Transfiera el telencéfalo dorsolateral a un tubo de 2 mL con un medio de disección frío (4 °C) hasta que se disecen todos los cerebros.
>2. Disociación celular y enchapado
- Prepare el medio de proliferación (50 mL de DMEM+10% FCS): 44 mL de Medio de Águila Modificado con Dulbecco (DMEM), 5 mL de Suero Fetal para Terneros (FCS), 0,5 mL de glucosa al 40%, 0,5 mL de penicilina/estreptomicina (10.000 unidades/mL y 10.000 μg/mL). Filtrar-esterilizar el medio de proliferación.
- Prepare el medio de diferenciación (50 mL de DMEM + 2% B27): 48 mL de DMEM, 1 mL de B27, 0,5 mL de glucosa al 40%, 0,5 mL de penicilina/estreptomicina (10.000 unidades/mL y 10.000 μg/mL). Filtrar-esterilizar el medio de diferenciación.
- Después de la microdisección del telencéfalo dorsolateral de ratones E14, centrifugar el tubo con el tejido recolectado y el medio de disección frío (durante 5 min a 4 °C, 340 x g) para precipitar el tejido.
- Retirar el sobrenadante con una pipeta y añadir 1 mL de ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) precalentado (37 °C) (0,05%) para la digestión química. Incubar durante 15 min a 37 °C. Añadir 2 mL de medio de proliferación para detener la actividad de la tripsina.
- Pula la punta de una pipeta Pasteur de vidrio sobre un quemador de gas o un mechero Bunsen durante unos segundos para estrechar ligeramente la abertura. Lave la pipeta aspirando FCS para recubrir la punta. Para evitar burbujas, disocie las células mecánicamente con una pipeta Pasteur pulida al fuego y recubierta de FCS.
- Centrifugar las células (durante 5 min a 4 °C, 340 x g). Retire el sobrenadante con una pipeta. Añadir 1 mL de medio de proliferación y resuspender las células con una pipeta. Repita este paso una vez.
- Prepare una dilución 1:1 de la suspensión celular utilizando una solución de azul de tripano al 0,4%. Las células no viables serán azules. Usando una cámara de Neubauer, cuente el número de células viables (sin teñir).
- Diluir las células en un medio de proliferación para obtener 106 células/mL. Añadir 500 μL de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos (aproximadamente 2,5 × 105 células/cm2). Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2.
nota: No utilices cubreobjetos de vidrio, ya que pueden moverse durante el experimento y cambiar el campo de observación. Alternativamente, use placas de cultivo de tejidos con fondo de vidrio.
nota: Si no está utilizando placas múltiples tratadas con cultivo celular, es importante tratar previamente sus placas con Poly-D-Lysin (50 μg/ml) durante 2 h a 37 °C. Las placas tratadas con PDL se pueden almacenar a 4 °C después de lavarlas con agua destilada.