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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
NOTA: Las soluciones de cultivo celular deben prepararse utilizando procedimientos estériles en una cabina de seguridad biológica y filtrarse a 0,2 μm para evitar la contaminación.
1. Preparación de soluciones y medio de cultivo
- Prepare la solución de recubrimiento de laminina diluyendo 20 μL de 1 mg/mL de caldo de laminina en 2 mL de H2O destilado estéril. Prepare el día de la disección.
- Prepare una solución de parada de suero equino (caballo) al 10% agregando 5 mL de ES a 45 mL de 1x Solución de Sal Balanceada de Hank (HBSS). Filtro estéril mediante un sistema de filtro de 0,2 μm o una punta de filtro de jeringa. Conservar a 4 °C.
- Prepare una solución madre de albúmina sérica bovina (BSA) al 4% añadiendo 2 g de polvo de BSA a 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) y llevándola a un volumen final de 45 mL. Filtro estéril mediante un sistema de filtro de 0,2 μm o una punta de filtro de jeringa. Conservar a 4 °C.
- Prepare la solución madre de papaína diluyendo la papaína a 3 mg/ml en 1x HBSS. Filtro estéril mediante un sistema de filtro de 0,2 μm o una punta de filtro de jeringa. Conservar a -20 °C.
- Prepare la solución de desoxirribonucleasa (DNasa) añadiendo 20 mg de polvo de DNasa a la H2O estéril y llevándola a un volumen final de 20 mL. Filtro estéril mediante un sistema de filtro de 0,2 μm o una punta de filtro de jeringa. Conservar a -20 °C.
- Prepare una solución madre de ácido ascórbico añadiendo 352 mg de ácido ascórbico al H2O destilado estéril y llevándolo a un volumen final de 20 mL. Si es necesario, calentar en un baño a 37 °C para disolver. Filtro estéril mediante un sistema de filtro de 0,2 μm o una punta de filtro de jeringa. Conservar a -20 °C.
- Prepare el medio de cultivo celular agregando lo siguiente a 50 mL de medio Neurobasal: 500 μL de Glutamax (100x), 500 μL de suero equino, 1 mL de B-27, 100 μL de ácido ascórbico, 500 μL de penicilina-estreptomicina, 50 μL de kanamicina y 50 μL de ampicilina. Filtro estéril mediante un sistema de filtrado de 0,2 μm. Conservar a 4 °C.
- Prepare la solución Triton X-100 al 0,01 % añadiendo 1 ml de Triton X-100 en 9 ml de 1 PBS para crear una solución al 10 %. Como Triton X-100 es viscoso, pipetee lentamente para permitir que la punta se llene por completo. Calentar en un baño a 37 °C para disolver si es necesario. Conservar a 4 °C.
- Para diluir el 10% de las existencias de Triton X-100 al 0,01%, realice 3 diluciones en serie 1:10. Diluya 1 mL de caldo al 10% en 9 mL de 1x PBS para hacer una solución al 1%. Diluya 1 mL de solución al 1% en 9 mL de 1x PBS para hacer una solución al 0,1%. Diluya 1 mL de solución al 0,1% en 9 mL de 1x PBS para hacer una solución al 0,01%.
- Prepare soluciones de suero de cabra normal (NGS) al 10% y al 1% agregando 1 mL de NGS a 9 mL de 1x PBS para una solución al 10% y 100 μL de NGS a 9,9 mL de 1x PBS para hacer una solución al 1%.
- Preparar una solución madre de glutamato (100 mM) añadiendo 735 mg de ácido L(+)-glutámico al H2O destilado estéril y llevándolo a un volumen final de 50 mL. La solubilidad en esta concentración será un problema. La adición de pequeños volúmenes (100 μL) de ácido clorhídrico 1 M es suficiente para aumentar la solubilidad.
- Prepare la solución madre de NBQX (10 mM) añadiendo 50 mg de NBQX a H2O destilado estéril y llevándola a un volumen final de 13 mL.
>2. Preparación de platos de cultivo y cubreobjetos (Realizado el día antes de la disección)
>NOTA: Hemos descubierto que la combinación de tres agentes de recubrimiento, poli-L-lisina, poli-L-ornitina y laminina, permite una adhesión y viabilidad celular ideales.
- Coloque 10 placas de Petri de 35 mm en un gabinete de seguridad biológica. Coloque dos cubreobjetos circulares de 12 mm en cada plato y rellénelos con EtOH al 70% durante 10 min. Utilice una línea de vacío para aspirar el EtOH restante de cada plato, permitiendo que el EtOH se evapore por completo.
- Pipetee ~ 90-100 μL de solución de poli-L-lisina al 0,1% en cada cubreobjetos, asegurándose de que todo el cubreobjetos esté cubierto. Cubra los platos con tapas y colóquelos en una incubadora a 37 °C durante 1 h.
- Aspire la solución de poli-L-lisina restante de cada cubreobjetos y enjuague con H2O estéril.
- Repita los pasos 2.2 – 2.3 con una solución de poli-L-ornitina al 0,1%.
- De nuevo, repita los pasos 2.2 – 2.3 con una solución de laminina al 0,01%. Colocar en una incubadora de CO2 a 37 °C/5% hasta que esté lista para la siembra de células al día siguiente.
3. Disecciones embrionarias de ratón
>NOTA: Utilizamos entre 4 y 6 ratones preñados cronometrados por cultivo. Si bien gran parte del proceso de disección ocurre fuera de un gabinete de seguridad biológica, sigue siendo importante mantener un procedimiento estéril. Lo ideal es el uso abundante de EtOH al 70% en superficies cercanas al microscopio de disección y en herramientas quirúrgicas. También se puede usar una mascarilla durante la disección para prevenir aún más la contaminación. Además, utilizamos 4 antibióticos separados en el medio de cultivo, por lo que es poco probable que se contamine. Sin embargo, si el uso de antibióticos es problemático, esta configuración de disección podría trasladarse dentro de una campana estéril. Para preservar la viabilidad celular, todas las soluciones de disección deben enfriarse previamente a 4 °C, y las disecciones deben completarse lo más rápido posible. No realizamos las disecciones en hielo. El método para la disección de las neuronas embrionarias del mesencéfalo de ratón es idéntico a los métodos descritos anteriormente.
- Prepare un espacio en un banco cerca de un microscopio de disección con una almohadilla absorbente y rocíe generosamente con EtOH al 70%.
- Rocíe dos placas de Petri de vidrio de 100 x 15 mm y una placa de Petri de vidrio de 50 x 10 mm con 70% de EtOH y deje que el EtOH se evapore. Una vez evaporado, coloque 50 mL de HBSS estéril 1x en cada placa de Petri de 100 x 15 mm.
- Sumerja las tijeras quirúrgicas, las pinzas y la hoja del micrótomo en EtOH al 70% durante un mínimo de 10 minutos para esterilizar. Coloque los instrumentos en la almohadilla absorbente para que se sequen.
- Usando CO2 seguido de dislocación cervical, eutanasia a ratones de 2-3 meses de edad con embarazo cronometrado en el día embrionario 14.
- Rocíe el abdomen de los ratones sacrificados con EtOH al 70%. Con fórceps, agarre la parte inferior del abdomen y abra la cavidad abdominal con unas tijeras quirúrgicas. Comience a cortar cerca de donde las pinzas sostienen el abdomen, haciendo cortes laterales a cada lado hasta que la pared abdominal se pueda plegar hacia atrás y el útero sea claramente visible.
- Con unas tijeras quirúrgicas, corte ambos extremos del cuerno uterino. Luego, retire el útero y colóquelo en una placa de Petri con 1x HBSS.
- Con pinzas de punta recta, extraiga cuidadosamente los embriones del útero. Deje los embriones en HBSS durante todo este proceso. Usando las pinzas o una cuchilla de micrótomo, decapita rápidamente los embriones cortando cerca del cuello. Hacer un corte lo más nivelado posible.
- Bajo un microscopio de disección, mueva la cabeza de un embrión a una placa de Petri seca de 50 mm y colóquela en el lado ventral. Estabilice la cabeza con fórceps colocando y penetrando cerca de los ojos/hocico. Las pinzas deben estar inclinadas hacia abajo a ~45° para evitar penetrar en el mesencéfalo.
- Con las pinzas, por otro lado, retire con cuidado la capa translúcida de piel y cráneo justo antes de la cresta prominente del mesencéfalo. Comience cerca de la línea media y retire la piel y el cráneo caudalmente hasta que el mesencéfalo esté completamente expuesto.
- Sostenga las pinzas perpendiculares al mesencéfalo expuesto, con una punta entre la corteza y el mesencéfalo y la otra cerca del cerebelo. Presione hacia abajo y apriete las pinzas para extraer todo el mesencéfalo. El segmento del mesencéfalo debe tener aproximadamente 0,5 mm de grosor. Coloque el segmento del mesencéfalo en la segunda placa de Petri llena de HBSS 1x fresco. Repite este proceso para cada embrión.
- Usando el microscopio de disección, coloque el segmento de cerebro con el lado ventral hacia arriba. Si las meninges aún están unidas, retírelas con cuidado agarrándolas con las pinzas y elevándolas hacia arriba y lejos del segmento cerebral.
- El segmento del cerebro debe tener 4 cuadrantes visibles. Coloque el segmento de tal manera que los dos cuadrantes más pequeños se coloquen por encima de los dos cuadrantes más grandes. Hay una cresta prominente que separa los dos cuadrantes superiores (pequeños) de los dos cuadrantes inferiores (grandes).
- Con las pinzas, pellizque y separe los cuadrantes superiores de los cuadrantes inferiores y luego deseche los cuadrantes superiores. Los cuadrantes inferiores restantes tendrán un exceso de tejido lateralmente en el lado dorsal, este tejido se verá menos opaco que el tejido ventral restante. Retire el tejido dorsal menos denso y deséchelo. El segmento restante debe contener tanto la sustancia negra pars compacta (SNc) como el área tegmental ventral (VTA).
- Con las pinzas, corte el segmento de tejido ventral restante en 4 piezas más pequeñas y, con una pipeta de diámetro ancho de 1 mL, transfiera estos segmentos en un tubo cónico de 15 mL con 1x HBSS. Mantenga el tubo cónico con segmentos cerebrales en hielo durante todo el procedimiento.
- Repita este proceso para todos los segmentos cerebrales restantes.
>4. Disociación de células
- Digestión enzimática de las células
- Aspire cuidadosamente el HBSS del tubo cónico de 15 mL que contiene segmentos del mesencéfalo, dejando los segmentos en la parte inferior del tubo.
- Agregue ~ 800 μL de solución de papaína al tubo y colóquelo en una incubadora a 37 °C durante 7 min. Vuelva a suspender las células moviendo el tubo y reemplácelo con la incubadora a 37 °C durante 7 minutos adicionales.
- Con una punta de pipeta de 1 mL de diámetro ancho, extraiga solo los segmentos del mesencéfalo en una alícuota de 1 mL de DNasa. Deje que los segmentos alcancen la parte inferior de la alícuota o aproximadamente 1 minuto de exposición.
- Con una punta de pipeta de 1 mL de diámetro ancho, extraiga solo los segmentos del mesencéfalo y colóquelos en un tubo cónico de 15 mL que contenga 2 mL de solución de parada. Deje que los segmentos se asienten en el fondo del tubo y repita el enjuague en un tubo cónico adicional lleno de solución de tapón.
- Trituración mecánica de la suspensión celular
- En la segunda parada, el tubo de enjuague de la solución, utilizando una punta de pipeta de 1 ml de diámetro ancho, pipetee las células hacia arriba y hacia abajo 10 veces hasta que no queden grandes segmentos de tejido visibles. Es importante evitar la sobretitulación para minimizar la lisis celular.
- Pipetear lentamente 300 μL de solución de BSA al 4% en el fondo del tubo cónico de 15 mL que contiene segmentos cerebrales. Retire con cuidado la punta de la pipeta para mantener una capa de suspensión. Centrifugar a 0,4 x g durante 3 min. A continuación, aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 400 μL de medio de cultivo celular.
5. Enchapado de las células
>NOTA: Según la experiencia, se recolectan alrededor de 100,000 células viables por embrión. Las ratas embarazadas cronometradas de 2-3 meses de edad suelen tener tamaños de camada de 8-10 embriones; por lo tanto, una estimación aproximada del rendimiento total de células por ratón preñada cronometrada es de aproximadamente 1 millón de células.
- Con un hemocitómetro, realice un recuento de células y luego diluya la suspensión a 2.000 células/μL utilizando un medio de cultivo celular. Triturar brevemente para mezclar.
- Retire los cubreobjetos con solución de laminina del paso 2 de la incubadora y aspire la solución de laminina restante de los cubreobjetos recubiertos con una aspiradora. Coloque una placa rápida para evitar que los cubreobjetos se sequen por completo. Pipetear 100 μL (2,0 x 105 células/cubreobjetos) en cada cubreobjetos y colocar placas de Petri en una incubadora a 37 °C durante 1 h.
- Agregue con cuidado 3 mL de medio de cultivo celular a cada placa y vuelva a colocarla en la incubadora a 37 °C. Realice cambios de medio medio dos veces por semana durante 2 semanas.
>6. Infección de cultivo celular en 14 DIV con vectores virales adenoasociados (AAV)
- Para cada plato, prepare 1 ml de medio DMEM sin suero con 1 μl de hSyn-GCaMP6f AAV (1,0 x 1013 títulos)
- Aspire el medio de cultivo celular de cada placa y reemplácelo con 1 mL de DMEM sin suero que contenga hSyn-GCaMP6f. A continuación, vuelva a colocar las placas en la incubadora a 37 °C durante 1 h.
- Aspire el medio libre de suero que contiene AAV y reemplácelo con 3 mL de medio de cultivo celular. Vuelva a colocar las placas en la incubadora a 37 °C. Hemos encontrado que 5-7 días de infección por AAV permiten niveles ideales de expresión de GCaMP. A lo largo de este período de infección viral, continúe cambiando el medio cada 2-3 días.
>7. Imágenes confocales de Ca2+ en vivo entre 19-21 DIV
- Preparación de búferes de grabación
- Para producir 1 L de tampón de registro HEPES, añada: 9,009 g de NaCl, 0,3728 g de KCl, 0,901 g de D-glucosa, 2,381 g de HEPES, 2 mL de solución madre de CaCl2 1 M y 500 μL de solución madre de 1 M de MgCl2 a 800 mL de H2O. Lleve el pH a 7,4 con NaOH. Llevar a un volumen final de 1 L.
- Para hacer 200 mL de tampón de registro de glutamato de 20 μM, diluya 40 μL de solución madre de glutamato de 100 mM en 200 mL de tampón de registro HEPES descrito anteriormente.
- Para producir 200 ml de tampón de registro NBQX de 10 μM, diluya 200 μL de solución madre de NBQX de 10 mM en 200 ml de tampón de registro HEPES.
- Imágenes confocales
- Llene una placa de Petri estéril de 35 mm con 3 ml de tampón de grabación.
- Retire una placa de Petri de 35 mm con cultivos infectados de la incubadora a 37 °C. Con pinzas de punta fina, agarre con cuidado el borde de un cubreobjetos y transfiéralo rápidamente a la placa de Petri llena de tampón de grabación. Vuelva a colocar el cubreobjetos restante en el medio en la incubadora a 37 °C. Transporte la placa con el tampón de registro al microscopio confocal.
- Inicie el software de imágenes. Continúe con el siguiente paso mientras se inicializa.
- Ponga en marcha la bomba peristáltica y coloque la línea en el tampón de registro. Calibra la velocidad del flujo para que sea de 2 mL/min.
- Transfiera el cubreobjetos infectado de la placa de Petri de 35 mm al baño de registro.
- Usando el objetivo de inmersión en agua 10x y la luz BF, encuentre el plano de enfoque y busque una región con una alta densidad de cuerpos de células neuronales. Cambie al objetivo de inmersión en agua de 40x y, con luz BF, vuelva a enfocar la muestra.
- En la ventana "Lista de tintes" dentro de FluoView, seleccione AlexaFluor 488 y aplíquelo.
- La expresión de AAV puede ser variable; por lo tanto, para evitar la sobreexposición y el fotoblanqueo de los fluoróforos, comience con ajustes bajos de HV y potencia láser. Para el canal AlexaFluor 488, establezca el alto voltaje (HV) en 500, la ganancia en 1x y el desplazamiento en 0. Para la línea láser 488, ajuste la potencia al 5%. Para aumentar el volumen efectivo visualizado en el plano z, aumente el tamaño del agujero de alfiler a 300 μm. Utilice la opción de escaneo "focus x2" para ajustar de forma óptima las señales de emisión a niveles de subsaturación. A partir de aquí, la configuración se puede ajustar hasta lograr la visibilidad ideal de cada canal.
nota: Para capturar con precisión la gama completa de flujos de Ca2+ con GCaMP, ajuste la configuración básica de alta tensión y potencia del láser para permitir un aumento en la intensidad fluorescente sin sobresaturar el detector.
- Una vez optimizados los ajustes del microscopio, mueva la platina para localizar una región con varias células que muestren cambios espontáneos en la fluorescencia de GCaMP6f y concéntrese en el plano deseado para la obtención de imágenes.
- Utilice la herramienta "Recortar rectángulo" para recortar el fotograma de la imagen a un tamaño que pueda alcanzar un intervalo de fotogramas de poco menos de 1 segundo. Esto es necesario para establecer el intervalo de imagen en 1 fotograma por segundo.
- Establezca la ventana "Intervalo" en un valor de 1.0 y la ventana "Num" en 600.
nota: Con el fin de suministrar diferentes tampones de registro en el punto de tiempo deseado (300 s), es importante calibrar la latencia de la bomba para entregar la nueva solución al baño. Esto dependerá de la velocidad de perfusión de la solución (2 mL/min) y de la longitud de la línea utilizada para bombear la solución.
- Para capturar una película de la serie t, seleccione la opción "Tiempo" y, a continuación, utilice la opción de escaneo "XYt" para comenzar la toma de imágenes.
- Observe la barra de progreso de imágenes y mueva la línea desde el tampón de registro HEPES al tampón de registro de glutamato de 20 μM en el punto de tiempo apropiado (por ejemplo, si la latencia de la bomba está calibrada para administrar solución a 60 s, mueva la línea al tampón de glutamato a 240 fotogramas para administrar glutamato a 300 s).
- Una vez finalizada la imagen, seleccione el botón Serie finalizada y guarde la película de la serie t terminada. Continúe perfundiendo 20 μM de glutamato durante 5 minutos adicionales, de modo que las neuronas cultivadas hayan estado expuestas al glutamato durante un total de 10 minutos. Repita este proceso para cada cubreobjetos que se vaya a fotografiar.
- Después de la exposición adicional de 5 minutos a 20 μM de glutamato, retire el cubreobjetos del baño y vuelva a colocarlo en la placa de Petri de 35 mm que contiene el tampón de registro hasta que se complete el día de la imagen.