Preparación de rodajas de corteza rinal e hipocampo a partir del cerebro de un cachorro de rata

Resumen

Fuente: Valente, C. A., et al., Un modelo de epileptogénesis en cultivos de corte organotípico de corteza rinal-hipocampo. J. Vis. Exp. (2021)

El video muestra un método para obtener cortes de corteza rinal e hipocampo del cerebro de una cría de rata y cultivarlos en insertos membranosos dentro de una placa de pocillos múltiples llena de medios para su posterior análisis.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

>1. Preparación de cortezas de corteza rinal e hipocampo

NOTA: La preparación de cortezas de corteza rinal-hipocampo utiliza ratas P6-7 Sprague-Dawley.

1. Montaje del cultivo y preparación del medio
   1. El día antes del cultivo, prepare los medios necesarios y colóquelos a 4 °C.
   2. Preparar el medio de disección: 25 mM de glucosa en la solución salina equilibrada (GBSS) de Gey.
   3. Medio de cultivo preparado: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% Suero de caballo (HS), 25 mM de glucosa, 30 μg/mL de gentamicina.
   4. Prepare el medio de mantenimiento: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutamina, 30 μg/mL de gentamicina, HS (15%, 10%, 5% y 0%).
2. Sustracción de cerebros
   1. Justo antes de iniciar el cultivo, añada 1,1 mL de medio de cultivo a cada pocillo de la placa de 6 pocillos con una pipeta P1000 y colóquelo a 37 °C.
   2. Coloque todo el equipo (microscopio de disección, picador de tejidos, lámpara de disección, herramientas de disección, electrodos, placas, insertos y papeles de filtro) dentro de la cabina de seguridad biológica y esterilice bajo luz ultravioleta durante 15 minutos.
   3. Ajuste el grosor de la rebanada a 350 μm.
   4. Retira el GBSS de la nevera. Agregue 5 mL de GBSS a seis placas de Petri. Se requerirán seis placas de Petri por animal.
   5. Sacrifica al cachorro de rata. Realizar la decapitación utilizando una tijera afilada en la base del tronco encefálico del animal.
   6. Lave la cabeza del animal tres veces en GBSS frío y llévela dentro del armario de seguridad.
3. Aislamiento de tejidos y preparación de lonchas
   1. Inserte firmemente pinzas afiladas en las cuencas de los ojos para sujetar la cabeza.
   2. Con una tijera fina, corte la piel/cuero cabelludo a lo largo de la línea media desde el agujero vertebral hacia los lóbulos frontales y déjelo a un lado.
   3. Se corta de la misma manera que el cráneo y a lo largo de la fisura transversal cerebral (espacio entre el cerebro y el cerebelo). Con pinzas largas curvas, sepárela.
   4. Deseche los bulbos olfativos con una espátula. Retire el cerebro de la cabeza y colóquelo en un GBSS helado con la superficie dorsal hacia arriba (Figura 1A).
   5. Inserte las pinzas finas en el cerebelo y recorra la línea media con la espátula abriendo cada hemisferio con mucho cuidado (Figura 1B).
   6. Con pinzas de curva corta, retire con cuidado el exceso de tejido que cubre el hipocampo, sin tocar la estructura del hipocampo. Luego, con una espátula, corte por debajo de cada hipocampo (Figura 1C).
   7. Toma un hemisferio y colócalo, con el hipocampo hacia arriba, sobre un papel de filtro. Repite el procedimiento con el otro hemisferio y colócalo paralelo al primero, en el papel de filtro. Coloque el papel de filtro en la picadora de pañuelos, con los hemisferios perpendiculares a la cuchilla, y corte los hemisferios en rodajas de 350 μm (Figura 1D).
   8. Coloque el tejido en rodajas en una placa de Petri con GBSS frío (Figura 1E).
   9. Separe cuidadosamente las rodajas con los electrodos de punta redonda (Figura 1F). Conserve solo las rodajas con una corteza rinal y un hipocampo estructuralmente intactos. Las áreas DG y CA deben estar perfectamente definidas, así como la corteza entorrinal y perirrinal (Figura 1G).
   10. Coloque cada rebanada en el inserto (Figura 1H-I), con una espátula y un electrodo de punta redonda. Retire el exceso de medio de disección alrededor de cada corte con una pipeta P20 (Figura 1J). Se pueden cultivar cuatro cortes de corteza rinal e hipocampo en un solo inserto (Figura 1K).
4. Mantenimiento de la cultura
   1. Cambia el medio cada dos días.
   2. Calentar el medio a 37 °C.
   3. Toma las placas de la incubadora. Levante cada inserto sujetando el borde de plástico con pinzas (Figura 1L).
   4. Use una mano libre para aspirar el medio desde el pozo. Vuelva a colocar el inserto en el pocillo y agregue 1 mL, con una pipeta P1000, de medio recién calentado (Figura 1M). Repita para todos los insertos. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas entre la membrana y el medio.

Resultados

Figura 1: Procedimiento detallado para la preparación de cortes organotípicos de corteza rinal-hipocampo. (A) Retire el cerebro de la cabeza y colóquelo en GBSS helado con la superficie dorsal hacia arriba. (B) Inserte las pinzas en el cerebelo. Abra el cerebro a través de la línea media y elimine el exceso de tejido sobre el hipocampo. (C) Con una e...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Hojas para mango de bisturí	Herramientas de Bellas Ciencias	10011-00
Sistema de cámara de corte de cerebro/tejido	Instrumentos Warner
Insertos para cultivos celulares, 30 mm, PTFE hidrófilo	Millipore SAS	PICM03050
Incubadora convencional	Thermo Scientific Heraeus	BB15, Línea de función	Ajustado a 37 °C y 5% CO2
D(+)-Glucosa monohidrato	Merck Millipore	1.08342.1000
Solución de D-(+)-glucosa, 45% en agua	sigma	G8769
hidrogenofosfato disódico dihidratado	Merck Milipore	1.06580.1000
Dumont #5 Pinza Fina Biologie Inox	Herramientas de Bellas Ciencias	11254-20
Pinzas Dumont #5 Standard Inox	Herramientas de Bellas Ciencias	11251-20
Pinzas Dumont #7 Estándar Dumoxel	Herramientas de Bellas Ciencias	11271-30
Pinza de #7S Dumont Medical Curva Corta Inox	Herramientas de Bellas Ciencias	11273-22
Solución madre de gentamicina, 50 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15750-037
Solución salina equilibrada de Gey (GBSS)	Industrias Biológicas	01-919-1A
Electrodos de vidrio	Productos Científicos	GB150F-10	Puntas redondas caseras
Pipetas Pasteur de vidrio, 230 mm	VWR Internacional	612-1702
Suero de caballo, inactivado por calor (HS)	Thermo Fisher Scientific	26050-088
Espátula de iris curvada	Herramientas de Bellas Ciencias	10092-12
Gabinete de seguridad biológica de clase II de labculture	HERASafe	SA 12
Solución de L-glutamina 200 mM (Q)	Thermo Fisher Scientific	25030-024
Medio Neurobasal-A (NBA)	Thermo Fisher Scientific	10888-022
Opti-MEM® I Sérum Reducido Medio	Thermo Fisher Scientific	31985-047
Platino 5 cuchillas	Gillette
Papel de filtro cualitativo, celulosa, grado 1, 55 mm	Whatman	1001-055	Media retención: 11 μm
Papel de filtro cualitativo, celulosa, grado 1, 90 mm	Whatman	1001-090	Media retención: 11 μm
Mango de bisturí	Herramientas de Bellas Ciencias	91003-12
Placas estériles de 6 pocillos tratadas con TC	Corning	CORN3516
Controlador de temperatura	CORPORACIÓN DE SISTEMAS MÉDICOS.	TC-102
Picadora de pañuelos	El Laboratorio Mickle Ingeniería CO. LTD.	MTC/2	Ajustado a 350 μm