Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Aislamiento, cultivo y estimulación de células NK
- Generar neurona nociceptora intacta (control de compañeros de camada; Ratones TRPV1wt::D TAfl/wt) y ablacionados (TRPV1cre::D TAfl/wt) cruzando ratones con toxina lox-stop-lox-diftheria (DTAfl/fl) con ratones TRPV1cre/wt.
- Usando la inhalación de CO2, eutanasia a un ratón de control de compañero de camada ingenuo (TRPV1wt::D TAfl/wt).
- Recoja el bazo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contenga 500 μL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
- Homogeneizar el bazo con un mortero.
- Diluir las células con 1 mL de PBS estéril.
- Filtre la mezcla a través de un colador de células de 50 μm en un tubo cónico de 15 mL.
- Rellene el volumen (10 mL) con PBS estéril.
- Recoja 10 μL y cuente las células con un hemocitómetro.
- Centrifugar las células (500 × g, 5 min) y eliminar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las células a una concentración de 108 células/mL en un medio RPMI 1640 suplementado.
- Siga las instrucciones del fabricante para purificar magnéticamente las células asesinas naturales (NK) del bazo utilizando un kit de aislamiento de células NK de ratón. Confirme la pureza de las células NK mediante citometría de flujo.
- Recoja 10 μL y cuente las células con un hemocitómetro.
- Centrifugar las células (500 × g, 5 min) y eliminar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las células NK en un medio de cultivo RPMI 1640 suplementado (que contenga IL-2 e IL-15).
- Cultivo 2 × 106 células NK/mL en una placa de fondo en U de 96 pocillos durante 48 h.
>2. Aislamiento y cultivo de neuronas DRG
- 24 h antes del final de la estimulación de la célula NK (paso 1.15), cubra una placa de 96 pocillos con 100 μL/pocillo de laminina (1 ng/mL) e incube durante 45 min (37 °C).
- Después de la incubación, retire la solución y deje que los pocillos se sequen al aire en una cabina de bioseguridad.
- Mediante inhalación de CO2, eutanasia de la neurona nociceptora intacta (control de compañeros de camada; TRPV1wt::D TAfl/wt) o ablacionados (TRPV1cre::D TAfl/wt) ratones.
NOTA: Se prefiere la inhalación de CO2 a la luxación cervical, ya que evita la alteración de los nervios espinales conectados al DRG (ganglio de la raíz dorsal).
- Asegure el ratón en el tablero en posición prona, levante la piel e incida la piel a lo largo de la columna dorsal.
- Cortar la articulación lumbosacra y separar el sacro de la columna lumbar con unas tijeras.
- Separe la columna vertebral cortando los músculos y las costillas a ambos lados de la columna vertebral en la dirección craneal hasta llegar a la base del cráneo.
- Con unas tijeras, corte la columna vertebral en la articulación atlanto-occipital.
- Elimina el músculo y el tejido graso de la columna vertebral.
- Sujete y abra la columna vertebral para extraer la médula espinal y obtener acceso al DRG. Busque el DRG en los agujeros intervertebrales conectados a la médula espinal a través de la raíz dorsal pero separados de las meninges.
- Coseche los DRG en un tubo cónico de 15 mL lleno con 10 mL de DMEM suplementado con hielo.
- Centrifugar la preparación (200 × g, 5 min, temperatura ambiente) y retirar el sobrenadante.
- Añadir 250 μL de PBS que contiene colagenasa IV (1 mg/mL) y dispasa II (2,4 U/mL).
- Incubar el DRG con una solución de colagenasa IV/dispasa II (C/D) (80 min, 37 °C, agitación suave). Al agrupar ganglios de varios ratones, mantenga una proporción de 125 μL de solución C/D por ganglio.
- Para inactivar las enzimas, agregue 5 mL de medio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) suplementado.
- Centrifugar la solución (200 × g, 5 min) y retirar suavemente el sobrenadante con una pipeta.
- Para evitar la pérdida celular no deseada, deje ~ 100 μL del sobrenadante.
- Añadir 1 mL de medio DMEM suplementado.
- Con una pistola de pipetas y tres pipetas Pasteur de vidrio de tamaños decrecientes, triture suavemente (~10 arriba/abajo por tamaño de pipeta Pasteur) el DRG en una preparación de una sola celda.
- En una cabina de bioseguridad, diluya la albúmina sérica bovina (BSA) en PBS estéril (solución salina tamponada con fosfato) hasta una concentración final del 15%. Almacene alícuotas de 1 ml a -20 °C.
- Cree un gradiente de BSA en un tubo cónico de 15 mL agregando 2 mL de PBS estéril y dispensando lentamente 1 mL de solución de BSA al 15% en la parte inferior del tubo. Evite interrumpir el gradiente retirando suavemente la pipeta.
- Con una pipeta P200, pipetee lentamente la suspensión de ganglios triturada (que contiene las neuronas) en el costado del tubo en el gradiente.
- Centrifugar el gradiente BSA que contiene neuronas (200 × g, 12 min, temperatura ambiente). Ajuste la aceleración y deceleración de la centrífuga a la velocidad mínima.
NOTA: Después de la centrifugación, las neuronas estarán en el fondo del tubo, mientras que los restos celulares quedarán atrapados en el gradiente BSA.
- Retire suavemente todo el sobrenadante con una pipeta.
- Resuspender las células en 500 μL de Neurobasal.
- Placa 104 neuronas por pocillo (200 μL de neurobasal/pocillo) en una placa de 96 pocillos recubierta de laminina.
NOTA: En promedio, un investigador podrá llenar ~ 8 pozos por ratón.
- Cultivar las neuronas (37 °C, durante la noche) para permitir la unión.
3. Co-cultura
- Retire lentamente el neurobasal del cultivo de neuronas.
- Después de 48 h de estimulación con IL-2 e IL-15 (ver pasos 1.14-1.15), resuspender las células NK y añadir 105 células NK/pocillo al cultivo de neuronas (placa de fondo plano de 96 pocillos)
NOTA: En promedio, el investigador podrá llenar ~ 6 pocillos por ratón.
- Cocultivo de las células en MX neurobasal suplementado (37 °C, 48 h).
