Aislamiento y cultivo de neuronas dopaminérgicas embrionarias primarias de ratón en el mesencéfalo

Resumen

Fuente: Er, S., et al. Estudiando la acumulación de α-sinucleína inducida por fibrillas preformadas en neuronas de dopamina del mesencéfalo embrionarias primarias de ratón. J. Vis. Exp. (2020).

El video muestra el proceso de aislamiento y cultivo de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de embriones de ratón. Los pisos ventrales aislados del mesencéfalo se disocian mediante enzimas. Las neuronas dopaminérgicas resultantes se recolectan y se transfieren a microislas dentro de placas de pocillos múltiples. Las células se incuban con un medio neuronal dopaminérgico para mantener las células a una alta densidad dentro de las microislas.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Preparación

1. Prepare el medio de neurona dopaminérgica (DPM) con 0,46% de D-glucosa, 1% de L-glutamina, 1% de N2, 0,2% de primocina, completado con la mezcla de medio/nutriente Eagle modificada de Dulbecco F-12 (DMEM/F12). Filtre el DPM después de mezclar los ingredientes. Almacene DPM a 4 °C y caliente cada alícuota solo una vez.
   nota: DPM no debe contener el factor de crecimiento derivado de la línea celular glial (GDNF), ya que reducirá la acumulación de α-sinucleína en las neuronas dopaminérgicas.
2. Preparar pipetas de vidrio siliconadas que sean extremadamente hidrofóbicas, minimizando así la adherencia a la superficie y la pérdida de células durante la manipulación inicial de las neuronas embrionarias.
   1. Agregue 10 mL de líquido siliconizante a 1 L de agua destilada y mezcle agitando en un recipiente de 2 L. Deje las pipetas de vidrio sumergidas en la solución siliconante durante 15 min.
   2. Enjuague las pipetas de 3 a 5 veces con agua destilada. Seque las pipetas durante la noche a temperatura ambiente (RT) o durante 1-2 h a 100-120 °C en un espacio estéril calentado para acelerar el secado.
   3. Esterilice las pipetas mediante autoclave estándar en una bolsa de autoclave sellada.
3. Prepare placas de 96 pocillos recubiertas de poli-L-ornitina (PO) con fondos transparentes agregando 60 μL de solución de PO en los pocillos centrales de la placa de 96 pocillos que se utilizará para la siembra de las neuronas, dejando al menos una fila/columna de pocillos en los bordes de la placa para evitar efectos de borde. Mantenga la placa recubierta durante la noche a 4 °C o 4 h a RT.
4. Antes de colocar las células, aspire la PO por completo y lave las células tres veces con 100 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x. Aspire 1x PBS de los pocillos y mantenga la tapa de la placa abierta para un secado completo.
   nota: Es posible recoger el PO usado y filtrarlo para su reutilización. Esto se puede repetir dos veces para la misma solución de PO.
5. Añadir 50 μL de DPM a los pocillos previamente recubiertos. Aspire DPM de los pocillos con una punta de plástico de 100 μL y rasque simultáneamente el fondo del pocillo con movimientos circulares para eliminar el recubrimiento en el perímetro de cada pocillo. Una isla recubierta de PO permanecerá en el centro del pozo.
6. Bajo una cubierta laminar, agregue 10 μL de DPM en el centro de cada isla recubierta para crear micro islas.
   nota: Una placa con microislas recubiertas de DPM puede mantenerse bajo la campana de flujo laminar durante 1-2 h durante el aislamiento de las células

>2. Aislamiento del suelo ventral del mesencéfalo de embriones de ratón del día 13.5 (E13.5)

1. Antes de la disección, llene una placa de Petri de 10 cm con el tampón de Dulbecco y manténgala en hielo.
2. Eutanasia a una rata hembra E13.5 preñada de acuerdo con las directrices de la institución. Coloque el ratón boca arriba y rocíe la parte anterior del cuerpo con etanol al 70%. Levante la piel por encima del útero con pinzas y haga una incisión con unas tijeras quirúrgicas para exponer el útero.
3. Retire con cuidado el útero y colóquelo en la placa de Petri previamente preparada sobre hielo.
4. Con unas tijeras quirúrgicas debajo de la capucha laminar en RT, extraiga con cuidado los embriones del útero. Retire todos los residuos placentarios de los embriones con pinzas y colóquelos en una nueva placa de Petri de 10 cm llena de tampón de Dulbecco.
5. Con pinzas de disección o agujas, corte el cuarto trasero de la cabeza desde los lugares marcados con flechas negras en la Figura 1A. Retire la pieza cortada del resto del embrión (Figura 1B).
6. Coloque la parte posterior de la pieza cortada hacia el observador (Figura 1C) y ábrala suavemente desde la caudal hasta la craneal (Figura 1D). A partir de 0,5 mm por debajo de la abertura craneal, corte una región de 2 mm² a 3 mm², como se muestra en la Figura 1E.
7. Recoja el piso ventral del mesencéfalo (véase la figura 1F) en un tubo de microcentrífuga vacío de 1,5 mL. Mantenga el tubo de microcentrífuga en hielo hasta que todos los pisos del mesencéfalo se recojan en él.
   nota: Alternativamente, los pisos del mesencéfalo se pueden recolectar con una micropipeta de 1 ml después de la disección de todos los cerebros embrionarios.

3. Establecimiento de cultivos embrionarios primarios del mesencéfalo a partir de embriones de ratón E13.5 en formato de placa de 96 pocillos

1. Después de la recolección de los pisos del mesencéfalo de todos los embriones en el mismo tubo de 1,5 mL, retire el tampón de Dulbecco residual y lave las piezas de tejido tres veces con 500 μL de solución salina balanceada de Hank (HBSS) sin Ca2⁺, Mg2⁺.
2. Retire el HBSS y añada 500 μL de tripsina al 0,5% al tubo. Incubar a 37 °C durante 30 min.
3. Durante la incubación, calentar 1,5 mL de suero fetal bovino (FBS) a 37 °C, añadir 30 μL de DNasa I al FBS y mezclar. Además, pula al fuego la punta de una pipeta de vidrio siliconado. Asegúrese de que el orificio no tenga bordes afilados y que tenga aproximadamente el mismo tamaño que la punta de una micropipeta de 1 ml.
   nota: Como alternativa, se puede utilizar una punta de micropipeta de 1 mL de baja adherencia para la trituración. Sin embargo, las pipetas de vidrio siliconadas parecen dar los mejores resultados.
4. Tan pronto como finalice la incubación en el paso 3.2, agregue 500 μL de la mezcla FBS/DNasa al tejido parcialmente digerido. Utilice la pipeta de vidrio para triturar el tejido en la mezcla de FBS y tripsina. Triturar hasta que los tejidos se disocien en partículas diminutas y apenas visibles. Evite las burbujas durante la trituración.
5. Deje que las partículas sobrantes precipiten en el fondo del tubo de microcentrífuga por gravedad. Sin pipetear el precipitado en la parte inferior, recoja el sobrenadante en un tubo cónico de polipropileno vacío de 15 mL.
6. Diluir FBS/DNasa I del paso 3.3 (98:2) con 1.000 μL de HBSS para obtener FBS/DNasa-I/HBSS (49:1:50). Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Añada 1.000 μL de la nueva mezcla a las partículas sobrantes en el tubo de microcentrífuga. Triture de nuevo y repita el paso 3.5.
7. Repita el paso anterior una vez más para utilizar todos los FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
8. Una vez que todo el sobrenadante se haya recogido dentro del tubo de 15 mL (de los pasos 3.5, 3.7 y 3.8), use una centrífuga de mesa para centrifugar el sobrenadante (~3 mL) a 100 x g, durante 5 min. Retire el sobrenadante sin tocar las células granuladas en la parte inferior.
9. Lave el pellet de celda agregando 2 mL de DPM al tubo y gírelo hacia abajo a 100 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y repita el lavado 2 veces para minimizar los residuos en las celdas peletizadas.
   nota: Utilice siempre DPM fresco y calentado para las neuronas cultivadas. Para los pasos de lavado, el DPM no tiene que ser fresco, sino que debe precalentarse a 37 °C.
10. Diluya las células con DPM fresco y tibio y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga. La cantidad de DPM para la dilución depende del número de embriones utilizados para la disección de tejidos. Por ejemplo, utilice 150 μL de DPM para diluir las células obtenidas de diez embriones.
11. Transfiera 10 μL de células en DPM a un tubo de microcentrífuga. Mézclalos con 10 μL de tinte azul Trypan al 0,4%. Cuente las células vivas (es decir, azul de tripano negativo) utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
    nota: Utilice 30.000 células para el recubrimiento por pocillo para obtener ~1.000 neuronas de dopamina por pocillo. Si la densidad celular es superior a ~ 30,000 celdas por 6 μL, diluya aún más las celdas con DPM antes de colocar el recubrimiento para que el volumen de siembra no sea inferior a 6 μL.
12. Sin tocar el fondo de los pozos, retire el DPM de las microislas creadas en el paso 1.6.
13. Con el fin de obtener una densidad celular reproducible en cada pocillo, mezcle las celdas mediante un pipeteo suave antes de la siembra en el pocillo. Con una micropipeta de 1 a 10 μL, añada 6 μL de células en el centro del pocillo, en la ubicación de cada microisla anterior.
14. Llene los pocillos vacíos en los bordes de la placa con 150 μL de agua o 1x PBS para minimizar la evaporación de los pocillos que contienen cultivos neuronales. Incubar la placa en una incubadora a 37 °C, 5% CO₂ durante 1 h.
15. Después de 1 h, retire la placa de la incubadora, agregue 100 μL de DPM en cada pocillo con celdas y vuelva a colocarla en la incubadora.
16. Dos días después de la siembra (día in vitro 2 o DIV2), retire 25 μL y agregue 75 μL de DPM fresco para llevar el volumen final del medio a 150 μL y evitar la evaporación tanto como sea posible.
17. Cambie la mitad del medio con DPM nuevo (es decir, elimine 75 μL y agregue 75 μL de DPM nuevo) en DIV5. No realice ningún cambio de medios después de DIV5.

Resultados

Figura 1: Disección del suelo del mesencéfalo de un embrión de ratón E13.5. (A) Los lugares de corte en el cuarto trasero de la cabeza están marcados con flechas negras y líneas discontinuas blancas. (B) La pieza fue extraída del resto del embrión. La pieza extraída se encierra en un círculo. (C) La pieza se giró 90° para mirar hacia la parte posteri...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.4% Tinción de Azul Trypan	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	15250061
Tubo de polipropileno CELLSTAR de 15 ml	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania	188261
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	10236276001
5 M HCl	N/A	N/A	Cocina multimedia, Instituto de Biotecnología, Universidad de Helsinki
5 M de NaOH	N/A	N/A	Cocina multimedia, Instituto de Biotecnología, Universidad de Helsinki
Placa de visualización de 96 pocillos (negro)	PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos	6005182
99,5% Etanol (EtOH)	Altia Oyj, Rajamäki, Finlandia	N/A
Fluido siliconizante AquaSil	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	TS-42799
Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml esterilizado en autoclave	N/A	N/A	Cocina multimedia, Instituto de Biotecnología, Universidad de Helsinki
Dispositivo de sonicación Bioruptor	Diagenode, Lieja, Bélgica	B01020001
Solución salina equilibrada de Hank's (HBSS) libre de Ca2+, Mg2+	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	14175-053
Paquetes de software CellProfiler y CellAnalyst	N/A	N/A	Software gratuito de código abierto
centrífuga 5702	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania	5702000019
Incubadora de CO2	HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	N/A
Cámara de recuento	BioRad Inc., Hércules, California, EE. UU.	1450015
Microscopio de ultra alta resolución DeltaVision con mesa de aire y gabinete	GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, EE. UU.	29254706
Desoxirribonucleasa-I (Dnasa I)	Roche, Basilea, Suiza	22098700
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	21331–020
El tampón de Dulbecco	N/A	N/A	Cocina multimedia, Instituto de Biotecnología, Universidad de Helsinki
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	10500056
D-glucosa	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	G8769
Tampón de fosfoato salino (PBS)	N/A	N/A	Cocina multimedia, Instituto de Biotecnología, Universidad de Helsinki
Primocina	InvivoGen, San Diego, California, EE. UU.	ant-pm-1, ant-pm-2
poli-L-ornitina	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	P4957
Tritón X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	11332481001
tripsina	MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China	2199700