Disección y montaje de explantes de cerebro de larvas de mosca de la fruta

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Disección y montaje de explantes de cerebro de larvas

1. Diseccionar los cerebros de las larvas en la solución salina externa fisiológica (120 mM de NaCl, 4 mM de MgCl₂, 3 mM de KCl, 10 mM de NaHCO₃, 10 mM de glucosa, 10 mM de sacarosa, 5 mM de ácido N-[tris(hidroximetil)metil]-2-aminoetanosulfónico (TES), 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES), 2 mM de Ca²⁺, pH 7,2) bajo un microscopio de disección (potencia de aumento de 4,5x) con dos pares de pinzas de disección de punta estándar #5 (11 cm). Use un par de pinzas para mantener el cuerpo de la larva en su lugar y el otro para diseccionar cuidadosamente el cerebro. Preserva los discos oculares, los lóbulos cerebrales y el cordón nervioso ventral. Retire los músculos adjuntos para minimizar los movimientos de la muestra durante la toma de imágenes.
2. Prepare un portaobjetos de vidrio (25 x 75 x 1,0 mm³) y use una jeringa para dibujar una cámara cuadrada con grasa al vacío.
3. Añadir 20 μL de solución salina externa a la cámara cuadrada con barreras de grasa.
4. Transfiera los cerebros de las larvas disecados a la cámara en el portaobjetos de vidrio con pinzas. Ajuste la posición de los cerebros debajo del endoscopio de disección para asegurarse de que el lado dorsal quede hacia arriba.
5. Cubra la cámara con un cubreobjetos de vidrio (22 x 22 x 0,15 mm³). El cerebro de la larva ahora está montado en el portaobjetos dentro de una cámara llena de la solución salina externa (Figura 1B).
   nota: La presión suave sobre el cubreobjetos confina el cerebro y reduce la deriva de la muestra en la siguiente sesión de imágenes.

Figura 1: Flujo de trabajo del protocolo de imagen y cuantificación de dinámica de dendritas. (A) El protocolo contiene seis pasos que abarcan la preparación de muestras, la recolección de imágenes, el procesamiento de imágenes y la cuantificación semiautomática de la dinámica de las dendritas. (B) Un diagrama esquemático que ilustra una cámara de imágenes que contiene un explante de cerebro larvario montado con el lado dorsal hacia arriba. El explante cerebral tiene una neurona lateral ventral (LNv) marcada individualmente en cada lóbulo y se sumerge en la solución salina externa. Las barreras de grasa al vacío soportan el peso del cubreobjetos y forman una pequeña cámara que impide que el cerebro se mueva.