Disección y montaje de explantes de cerebro de larvas de mosca de la fruta

En este artículo

Resumen

Fuente: Sheng, C., et al. Imágenes en vivo de lapso de tiempo y cuantificación de la dinámica rápida de ramas dendríticas en neuronas de Drosophila en desarrollo. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra la disección y montaje de explantes cerebrales de larvas de Drosophila. El sistema nervioso central (SNC), unido a los discos oculares, se extrae de las larvas y luego se monta en un portaobjetos de vidrio en una solución salina fisiológica.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Disección y montaje de explantes de cerebro de larvas

Diseccionar los cerebros de las larvas en la solución salina externa fisiológica (120 mM de NaCl, 4 mM de MgCl₂, 3 mM de KCl, 10 mM de NaHCO₃, 10 mM de glucosa, 10 mM de sacarosa, 5 mM de ácido N-[tris(hidroximetil)metil]-2-aminoetanosulfónico (TES), 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES), 2 mM de Ca²⁺, pH 7,2) bajo un microscopio de disección (potencia de aumento de 4,5x) con dos pares de pinzas de disección de punta estándar #5 (11 cm). Use un par de pinzas para mantener el cuerpo de la larva en su lugar y el otro para diseccionar cuidadosamente el cerebro. Preserva los discos oculares, los lóbulos cerebrales y el cordón nervioso ventral. Retire los músculos adjuntos para minimizar los movimientos de la muestra durante la toma de imágenes.
Prepare un portaobjetos de vidrio (25 x 75 x 1,0 mm³) y use una jeringa para dibujar una cámara cuadrada con grasa al vacío.
Añadir 20 μL de solución salina externa a la cámara cuadrada con barreras de grasa.
Transfiera los cerebros de las larvas disecados a la cámara en el portaobjetos de vidrio con pinzas. Ajuste la posición de los cerebros debajo del endoscopio de disección para asegurarse de que el lado dorsal quede hacia arriba.
Cubra la cámara con un cubreobjetos de vidrio (22 x 22 x 0,15 mm³). El cerebro de la larva ahora está montado en el portaobjetos dentro de una cámara llena de la solución salina externa (Figura 1B).
nota: La presión suave sobre el cubreobjetos confina el cerebro y reduce la deriva de la muestra en la siguiente sesión de imágenes.

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Resultados

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Figura 1: Flujo de trabajo del protocolo de imagen y cuantificación de dinámica de dendritas. (A) El protocolo contiene seis pasos que abarcan la preparación de muestras, la recolección de imágenes, el procesamiento de imágenes y la cuantificación semiautomática de la dinámica de las dendritas. (B) Un diagrama esquemático que ilustra una cámara de imágenes que con...