Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas en células progenitoras neurales

Resumen

Fuente: Phillips, A. W., et al. Desarrollo de cuerpos embrioides libres de suero derivados de HiPSC para la interrogación de cultivos de células madre en 3D utilizando ensayos fisiológicamente relevantes. J. Vis. Exp. (2017).

El video muestra una técnica para diferenciar células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) en células progenitoras neurales (NPCs). Inicialmente, las hiPSC se cultivan en una capa alimentadora de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF). Posteriormente, las células se separan y se transfieren a una placa recubierta de biopolímero para permitir que los MEF se adhieran y se separen de las hiPSC. A continuación, las hiPSC suspendidas se transfieren a una placa inferior en V y se centrifugan para formar agregados. Finalmente, la adición de un medio de diferenciación induce la diferenciación de hiPSCs dentro del agregado en NPCs.

Protocolo

1. Generación de Células Progenitoras Neurales

1. Mantener hiPSCs derivadas de fibroblastos y células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) en placas de 6 pocillos en una capa de células alimentadoras embrionarias de ratón (MEF) irradiadas con γ en medio iPSC humano suplementado con moléculas pequeñas.
   NOTA: El mantenimiento diario es una versión modificada de los procedimientos informados anteriormente.
   1. Coloque 6 x 10⁵ MEF en cada pocillo de una placa de grado de cultivo de tejidos de 6 pocillos en el medio recomendado de 300 μL/pocillo (siguiendo el protocolo del fabricante).
   2. Después de 48 h, reemplace el medio MEF con medio hiPSC de 300 μL/pocillo durante 1 h antes de agregar hiPSC.
   3. Descongele rápidamente las hiPSC en un baño de agua a 37 °C y agregue lentamente 1 mL de hiPSC medio gota a gota. Transfiera las hiPSC y el medio a un tubo cónico de 15 mL. Agregue medio para llevar el volumen total a 5 mL. Centrifugar durante 4 min a 129 x g, aspirar el sobrenadante, resuspender suavemente el pellet en medio hiPSC de 1 mL con inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK) a una concentración de 1:1.000.
   4. Coloque la suspensión celular (generalmente sembrada a 300,000 celdas/pocillo) en la capa celular de MEF e incube a 37 °C, 5% de CO₂, 95% de humedad.
   5. Monitoree de cerca el cultivo de iPSC con un microscopio óptico. Después de 48 h, retire los cultivos que tengan bordes irregulares, que hayan crecido hasta volverse quísticos o que parezcan marrón amarillento bajo el microscopio óptico para minimizar la diferenciación espontánea><. nota: Después de 7 a 10 días, deberían formarse colonias de hiPSC. Las colonias deben ser redondas, con bordes claramente definidos y densidades de celdas uniformes, y desprovistas de celdas no uniformes poco compactas.
   6. Seleccione manualmente colonias redondas de hiPSC para limpiar el cultivo de células diferenciadas espontáneamente. Expanda las colonias colocándolas sobre capas frescas de MEF. Expanda 1:3 cada 7 días cuando los cultivos se acerquen a la confluencia y se congelen.
2. Después de la expansión y congelación de las celdas (como respaldo), haga crecer las colonias de hiPSC en placas hasta que alcancen el 50 - 75% de confluencia.
3. Siete días después del enchapado, utilice un tratamiento enzimático suave (5-10 min con 300 μL de solución enzimática) y una trituración suave (2-4 veces con una pipeta de 1.000 μL) para cosechar y preparar hiPSC para la diferenciación de células precursoras neurales.
4. Centrifugar la suspensión celular a 129 x g durante 4 min, aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en medio iPSC humano de 5 mL. Transfiera la suspensión celular a una placa de cultivo celular de 5 cm recubierta de gelatina al 0,1% durante 1 h a 37 °C para eliminar los MEF y maximizar el rendimiento de hiPSC. Transfiera el medio (con células no adherentes) a otro plato recubierto de gelatina de 5 cm.
5. Transfiera las células no adherentes a un tubo de centrífuga de 15 mL utilizando una pipeta de transferencia. Enjuague suavemente las placas con medio de 3 ml y agréguelo al tubo de 15 ml.
6. Centrifugar la suspensión celular a 129 x g durante 4 min, aspirar el sobrenadante y resuspender suavemente el pellet en medio ambiente. Determine el recuento de células mediante un contador de células automatizado. Placa de 9.000 células/pocillo en una placa inferior en V de baja adherencia de 96 pocillos.
7. Centrifugar la placa a 163 x g durante 3 min. Incubar la placa a 37 °C, 95% de humedad y 5% de CO₂. Con una pipeta, cambie el medio al 50% cada dos días retirando la mitad del medio y sustituyéndolo por un medio diferenciador fresco químicamente definido 1 (DM1; Figura 1; Tabla de Materiales) durante 14 días.

Resultados

Figura 1: Esquema que describe los primeros pasos en la preparación de SFEB. Una vez que las iPSC se han cosechado mediante una disociación enzimática, se siembran en placas de 96 pocillos y se centrifugan a 163 x g durante 3 minutos para inducir una agregación rápida. Después de 14 días, los agregados celulares in vitro (DIV) se pueden transferir de placas de 96 pocillos a través de pipetas de diáme...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
SFEB Diferenciación Neuronal Medios de cultivo celular. Reactivos. Componentes
Medio de inducción neuronal STEMdiff (medios hiPSC)	Tecnologías STEMCELL	0-5835	250ml
PluriQ ES-DMEM Medio (MEF Media)	GlobalStem (en inglés)	GSM-2001
Componentes de medios DM1
D-MEM/F-12 (1X), líquido Glutamax, 1:1	Invitrogen	10565018	385 ml
Reemplazo de suero knockout	Invitrogen	10828028	20% 100ml
Pluma/Estreptococo	Invitrogen	15140122	5 ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5 ml
MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales 10 mM (100X), líquida	Invitrogen	11140050	5 ml
2-Mercaptoetanol (1.000X), líquido	Invitrogen	21985023	900ul
Moléculas pequeñas
Y27632 (ROCKi)	Derivante	04-0012-10	10uM
Componentes/Materiales
Fibroblastos embrionarios de ratón	GlobalStem (en inglés)	GSC-6301G
Fondo en V de 96 pocillos con tapas	perennifolio	222-8031-01V
Reactivo de disociación celular StemPro Accutase	ThermoFisher	A1110501
Fondo plano de 6 pozos	halcón	353046