Desarrollo y mantenimiento de cuerpos embrioides libres de suero

Resumen

Fuente: Phillips, A. W., et al. Desarrollo de cuerpos embrioides libres de suero derivados de HiPSC para la interrogación de cultivos de células madre en 3D utilizando ensayos fisiológicamente relevantes. J. Vis. Exp. (2017).

El video describe el procedimiento para desarrollar cuerpos embrioides libres de suero (SFEBs) a partir de células progenitoras neuronales utilizando varios medios de diferenciación libres de suero o DM. DM-2 facilita la maduración y disposición de las neuronas para formar SFEBs, mientras que DM-3 se utiliza para el mantenimiento del crecimiento.

Protocolo

>1. Inducción del cuerpo embrioide libre de suero (SFEB) (Figura 1)

1. Coloque insertos de cultivo celular de 40 μm en placas de 6 pocillos y agregue 1 mL de medio de diferenciación 1 (DM1) (Tabla de materiales) al menos 1 h antes de agregar agregados.
2. Transfiera los agregados de células progenitoras neurales con un medio de 20 μL utilizando una punta de boca ancha de 200 μL a insertos de cultivo celular de 40 μm y cambie el medio a DM2 (Tabla de Materiales).
   nota: Los insertos de cultivo celular son insertos especializados que se asientan ligeramente fuera del fondo del pocillo y consisten en una membrana de politetrafluoroetileno suspendida sobre un marco de plástico. Esta membrana es biocompatible y puede sostener de manera eficiente el transporte de nutrientes y oxígeno a los SFEB colocados en la parte superior. Se usan comúnmente con cultivos organotípicos de cortes de hipocampo tomados de un ratón o rata.
   1. Transfiera de 4 a 6 agregados a un inserto de cultivo celular y deje un espacio adecuado entre los agregados. Retire la mayor cantidad posible de exceso de solución con una punta de pipeta fina (por ejemplo, punta de 200 μL).
      NOTA: Es aceptable perturbar brevemente los SFEB, ya que se moverán sobre el inserto de cultivo celular a medida que se retire la solución alrededor de los SFEB.
   2. Mantener los cultivos en 1 mL de DM2 a 37 °C, 95% de humedad y 5% de CO2. Con una pipeta, cambie el 75% del medio cada dos días retirando tres cuartas partes del medio y sustituyéndolo por tres cuartas partes del medio fresco. Por ejemplo, retire 750 μL de medio y agregue 750 μL de medio fresco.
3. Después de 14 días de cultivo, cambie a medio DM3 (Tabla de Materiales) con un 75% de cambio de medio cada dos días y durante otros 16 días.
4. Para mantener los SFEB en los insertos de cultivo celular más allá de 30 días, cambie el medio cada dos días durante 60, 90 y 120 días.
   nota: Los SFEB crecerán hasta aproximadamente 1.000 μm de diámetro y suelen tener un grosor de 100-150 μm.
5. Separe los SFEB del inserto pipeteando suavemente el medio con una punta de pipeta de boca ancha de 200 μL. Para transferir los SFEB, utilice una punta de pipeta de boca ancha para succionar suavemente los cuerpos en la punta de la pipeta. Después de cargar SFEB en la punta de la pipeta, transfiéralo suavemente a placas de 12 pocillos y lávese con 300 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por pocillo.

Resultados

Figura 1: Cronología de los cambios y fases del medio durante el crecimiento y la expansión de la SBEB.

Después de que los SFEB se han transferido a los insertos, se someten a dos cambios de medio a los 14 y 28 días in vitro (DIV). Por lo general, se cosechan para experimentos en DIV 30, 60 y 90. Los recuadros superiores muestran diferentes fases en es...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
SFEB Diferenciación Neuronal Medios de cultivo celular. Reactivos. Componentes
Medio de inducción neuronal STEMdiff (medios hiPSC)	Tecnologías STEMCELL	0-5835	250ml
PluriQ ES-DMEM Medio (MEF Media)	GlobalStem (en inglés)	GSM-2001
Componentes de medios DM1
D-MEM/F-12 (1X), líquido Glutamax, 1:1	Invitrogen	10565018	385 ml
Reemplazo de suero knockout	Invitrogen	10828028	20% 100ml
Pluma/Estreptococo	Invitrogen	15140122	5 ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5 ml
MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales 10 mM (100X), líquida	Invitrogen	11140050	5 ml
2-Mercaptoetanol (1.000X), líquido	Invitrogen	21985023	900ul
Componentes de medios DM2
D-MEM/F-12 (1X), líquido Glutamax, 1:1	Invitrogen	10565018	500 ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5 ml
Pluma/Estreptococo	Invitrogen	15140122	5 ml
Suplemento N-2 (100X), líquido	Invitrogen	17502048	10 ml
Componentes de medios DM3
Medio NEUROBASAL (1X), líquido	Invitrogen	21103049	500 ml
Suplemento de B-27 Menos Vitamina A (50X), líquido	Invitrogen	12587010	10 ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5 ml
Pluma/Estreptococo	Invitrogen	15140122	5 ml
Componentes/Materiales
	Milicelda	PICM0RG50
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	ThermoFisher	10010023	500 mL