Construcción de circuitos neuronales con patrones en una guía de electrodos múltiples

En este artículo

Resumen

Fuente: Kanner, S., et al. Diseño, Tratamiento de Superficies, Recubrimiento Celular y Cultivo de Redes Neuronales Modulares Compuestas por Circuitos Funcionalmente Interconectados. J. Vis. Exp. (2015)

Este video muestra el proceso de cultivo de células neuronales en una matriz de electrodos múltiples (MEA) con patrones para establecer redes neuronales modulares. Este método permite el estudio de la transmisión de señales neuronales y las interacciones celulares.

Protocolo

1. Preparación de matrices de electrodos múltiples (MEA)

Limpie MEA en este orden (Tabla de Materiales):
1. Lavar con agua del grifo y sonicar en un detergente enzimático concentrado 3 veces.
2. Sonicato en agua destilada 3 veces.
3. Lavar con agua destilada (en capucha, punta de 1.000 μl) 3 veces y colocar bajo rayos ultravioleta (UV) durante 30 min.
Apoyo a la preparación de la red:
1. Prepare el molde de red de soporte diseñado.
  1. Vierta el polidimetilsiloxano (PDMS) en una placa de 12 pocillos (22 mm de diámetro).
  2. Cuando el PDMS esté endurecido, retira el molde y, con un bisturí, corta un agujero en el medio para crear una forma de anillo.
  3. Coloque un molde de red de soporte diseñado en el centro del MEA (Figura 1A) y cubra el resto de la superficie con poli-D-lisina (PDL) durante 2 horas a temperatura ambiente (RT).
2. Retire el PDL con una pipeta y lávelo con agua destilada.
3. Retirar el molde y dejar secar (Figura 1A).
Alinee la galería de símbolos con MEA de la siguiente manera:
1. Coloque la plantilla en el micromanipulador designado. Utilice un microscopio invertido para alinear con precisión la estructura del patrón con los electrodos y baje la plantilla hasta que se coloque en la superficie de MEA (Figura 1B).
  nota: El contacto con un MEA bien limpio proporciona una adhesión competitiva entre el PDMS y el propio MEA.
2. Levante el micromanipulador y, si es necesario, use pinzas para aplicar una pequeña cantidad de presión por encima del PDMS para evitar que se desprenda del MEA.
3. Presione suavemente la plantilla contra la superficie de MEA y use un microscopio para verificar que esté firmemente adherida y bien alineada (Figura 1C-D).
Coloque MEA en una cámara de vacío durante 15 minutos; coloque una gota de 1 ml de PDL en la plantilla.
Insértelo en la cámara de vacío 2 veces durante 20 minutos cada una. Deje que el PDL se seque O/N en la incubadora.
Antes de enchapar, retire las plantillas de PDMS de los MEA y lávelas con agua estéril. Colocar bajo iluminación UV durante 7 min.

>2. Enchapado

Calcule el número de células necesarias para la siembra con un hemocitómetro
1. Asegúrese de que la cámara de conteo (hemocitómetro) esté limpia y colóquele un cubreobjetos (use alcohol para limpiar).
2. Diluir 10 μl de la suspensión celular en 190 μl de medio de siembra (dilución 1:20).
3. Cargue 10 μl de las células diluidas en el borde de la cámara de recuento y pipetee lentamente las células, permitiendo que la cámara se llene sola.
4. Usando un microscopio invertido, visualice la cuadrícula del hemocitómetro. Determine el número de células en la cámara mediante conteo directo (las células sanas deben ser redondas). Cuente las celdas dentro del cuadrado grande sin las que cruzan los bordes.
5. Calcular la concentración de células:
  Número total de células/1000 μl = Número total de células contadas × factor de dilución × 10⁴ (área del hemocitómetro).
  nota: Por ejemplo, si el factor de dilución era 20 y el total de células contadas era 100:
  100 × 20 × 10⁴ = 0,1 x 10⁷ células/1.000 μl o 1 x 10⁶/100 μl. Para colocar una placa de 0,75 x 10⁶ células, extraiga 75 μl de las células.
Tome el número de células necesarias para la siembra por placa de MEA o Petri, vuelva a suspender las células para evitar la agregación y colóquelas en el centro, encima del área con patrón (las células se pueden diluir en el medio si es necesario). Para el MEA, coloque una gota de 100 μl en el medio. Para el cubreobjetos, coloque una gota de 1.000 μl en el centro.
Incubar las células plantadas a 37 °C durante 40 min. Añadir medio de siembra a las células plantadas, hasta 1 ml por MEA y 2 ml por cubreobjetos.
Mantener a 37 °C y diluir con un medio de crecimiento fresco enriquecido con 0,5 Pen-Strep, 2% B-27 y 0,75% glutamax cada 4 días.
A partir de 6/7 DIV, después de ver las conexiones entre las islas, diluir el medio con 10 μl/ml de FUDR (25 mg de desoxiuridina + 62,5 mg de uridina en 12,5 ml de MEM (Minimum Essential Medium Eagle)) o cualquier otro agente antimitótico para prevenir el sobrecrecimiento glial.

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Resultados

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Figura 1. Deposición de estructuras de PDMS en un MEA. (A) Molde de PDMS con forma de anillo (marcado con la flecha roja) montado en un MEA. El molde se utiliza para recubrir el área destinada a la red neuronal de soporte y ubicada en la periferia del área de cultivo (esta está limitada por el anillo montado en el MEA y marcado con la flecha verde). (B) Alineación de una plantilla...