Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en neuronas motoras funcionales

Resumen

Fuente: Garone, M. G., et al. Conversión de Células Madre Pluripotentes Inducidas (iPSCs) Humanas en Neuronas Motoras Espinales y Craneales Funcionales Utilizando Vectores PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra el proceso de diferenciación de las iPSCs humanas en neuronas motoras. La justificación implica la utilización de iPSC que han sido modificadas genéticamente para expresar factores de transcripción específicos. Cuando se cultiva en un medio que contiene doxiciclina, este antibiótico desencadena la expresión de factores de transcripción, promoviendo así la diferenciación de iPSC en progenitores de neuronas motoras. En última instancia, los progenitores se cultivan en un medio neuronal para producir neuronas motoras maduras y funcionales.

Protocolo

1. Mantenimiento de las iPSCs humanas

1. Preparación de placas recubiertas de matriz
   1. Descongele un vial de 5 ml de matriz (consulte la tabla de materiales) a 4 °C durante la noche. Las existencias de la matriz original se presentan en diferentes concentraciones de existencias, y las alícuotas se realizan de acuerdo con el factor de dilución indicado en la hoja de datos y son específicas para cada lote. Es crucial mantener el vial y los tubos helados para evitar la gelificación prematura de la matriz. Dispense la matriz en alícuotas en criotubos preenfriados sobre hielo. Congele las alícuotas no utilizadas a -20 °C.
   2. Coloque una alícuota en hielo durante aproximadamente 2 h para descongelar.
   3. Diluir la alícuota de la matriz con 20 mL de DMEM/F12 frío en un tubo cónico de 50 mL.
   4. Mezclar bien y dispensar 1 mL de matriz diluida en platos de 35 mm (cantidades equivalentes por superficie de otros platos).
   5. Mantenga los platos que contienen matriz diluida durante 1 h a temperatura ambiente para permitir el recubrimiento.
      nota: Los platos, sellados con parafilm, pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
2. Preparación de la solución madre (20 mL) y 1x alícuotas de trabajo del reactivo de disociación celular suave (ver Tabla de Materiales).
   1. Disuelva el polvo a 10 mg/mL en PBS (libre de Ca²⁺/Mg²⁺)
   2. Esterilización por filtro a través de una membrana filtrante de 0,22 μm.
   3. Prepare 20 alícuotas (1 ml cada una) y guárdelas a -20 °C.
   4. Antes de usar, diluya una alícuota en PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ libre) a 1 mg/mL (1x alícuotas de trabajo).
      NOTA: 1x alícuotas de trabajo se puede almacenar a 4 °C durante 2 semanas.
3. Pasar iPSCs humanas.
   1. Antes de comenzar: Si se almacena a 4 °C, precaliente las placas recubiertas de matriz en la incubadora a 37 °C durante 20-30 min. Precaliente a temperatura ambiente la cantidad de medio iPSC humano (consulte la tabla de materiales) necesaria. Precalienta el DMEM/F12.
   2. Aspirar medio de cultivo.
   3. Enjuague las iPSC con PBS (libre de Ca²⁺/Mg²⁺).
   4. Añadir 1x solución de disociación suave (0,5 mL para un plato de 35 mm). Incubar a 37 °C hasta que los bordes de las colonias comiencen a desprenderse de la placa, generalmente 3-5 min.
   5. Aspirar la solución de disociación suave, teniendo cuidado de no desprender las colonias de iPSC.
   6. Lavar las celdas con DMEM/F12 (2 mL para un plato de 35 mm) y aspirar, teniendo cuidado de no desprender las celdas. Repita este paso una vez más.
   7. Agregue medio iPSC humano (1 mL para una antena de 35 mm).
   8. Separe suavemente las colonias con un elevador de células y transfiéralas a un tubo de 15 ml.
   9. Rompa suavemente los grumos de células pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000 3-4 veces.
   10. Aspire el sobrenadante de la(s) placa(s) recubierta(s) de matriz.
   11. Siembrar las células en el volumen de cultivo adecuado del medio iPSC humano. La relación de división puede variar de una línea a otra y es de aproximadamente 1:4-1:8. Cambie el medio a diario.

>2. Generación de líneas iPSC inducibles NIL y NIP

1. Transfección celular
   1. Enjuague las células con PBS (libre de Ca²⁺/Mg²⁺).
   2. Añadir reactivo de disociación celular (ver Tabla de Materiales) (0,35 mL para una placa de 35 mm) e incubar a 37 °C hasta que se separen las células individuales (5-10 min).
   3. Separación celular completa suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000 3-4 veces.
   4. Recoger en un tubo de 15 mL y añadir PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ libre) a 10 mL. Cuenta las celdas.
   5. Pellet 10⁶ celdas y resuspender en 100 μl de Tampón R (incluido en el kit de electroporación de celdas; ver Tabla de Materiales).
   6. Añadir ADN plasmídico para la transfección: 4,5 μg de vector transponible (epB-Bsd-TT-NIL o epB-Bsd-TT-NIP12) y 0,5 μg del plásmido transposasa piggyBac.
   7. Transfectar con el sistema de electroporación de la celda (ver Tabla de Materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y como se describió anteriormente con los siguientes parámetros: voltaje de 1.200 V, ancho de 30 ms, 1 pulso. Siembrar las células en un medio iPSC humano suplementado con 10 μM de Y-27632 (inhibidor de ROCK, ver Tabla de Materiales) en una placa recubierta de matriz de 6 mm.
2. Selección con antibióticos
   1. Dos días después de la transfección, añadir 5 μg/mL de blasticidina al medio de cultivo.
   2. La mayoría de las células no transfectadas morirán dentro de las 48 horas posteriores a la selección de blasticidina. Mantenga las células en blasticidina durante al menos 7-10 días para contraseleccionar las células que no han integrado los transgenes en el genoma.
   3. Mantener células transfectadas de forma estable como una población mixta, compuesta por células con diferentes números de transgenes y diferentes sitios de integración, o aislar clones individuales.
   4. Prepare una placa adicional para comprobar la expresión efectiva de los transgenes tras la inducción de 1 μg/mL de doxiciclina mediante RT-PCR con cebadores específicos de transgenes para Ngn2 (Adelante: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; Reverso: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT).
   5. En esta etapa, congele las existencias de las nuevas líneas NIL- y NIP-iPSC en un medio de congelación para iPSC humanas (véase la Tabla de Materiales).

>3. Diferenciación de las neuronas motoras

1. Disocie las células con el reactivo de disociación celular como se describe (pasos 2.1.1.-2.1.3.). Recoja las células disociadas en un tubo de 15 ml y diluya con 5 volúmenes de DMEM/F12. Granular las células y resuspender en un medio iPSC humano suplementado con 10 μM de inhibidor de ROCK. Cuente las células y la semilla en placas recubiertas de matriz a una densidad de 62.500 células/^cm2.
2. Al día siguiente, sustituya el medio por DMEM/F12, suplementado con 1 análogo de L-glutamina estable, 1 suplemento de cultivo celular de aminoácidos no esenciales (NEAA) y 0,5 veces penicilina/estreptomicina, que contiene 1 μg/mL de doxiciclina. Esto se considera como el día 0 de diferenciación. El día 1, refrescar el medio y la doxiciclina.
3. El día 2, cambie el medio a medio Neurobasal/B27 (medio Neurobasal suplementado con 1x B27, 1x análogo de L-glutamina estable, 1x NEAA y 0,5x penicilina/estreptomicina), que contiene 5 μM de DAPT, 4 μM de SU5402 y 1 μg/mL de doxiciclina (ver Tabla de Materiales). Refresque el medio y la doxiciclina todos los días hasta el día 5.
4. Día 5: Disociación de células con reactivo de disociación celular (ver Tabla de Materiales).
   1. Enjuague las células con PBS (libre de Ca²⁺/Mg²⁺).
   2. Añadir reactivo de disociación celular (0,35 mL para una placa de 35 mm) e incubar a 37 °C hasta que toda la monocapa celular se separe de la placa.
      NOTA que las células individuales no se separarán durante la incubación.
   3. Agregue 1 mL de DMEM/F12 y recoja las células en un tubo de 15 mL.
   4. Separación celular completa suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000 de 10 a 15 veces.
   5. Agregue 4 mL de DMEM/F12 y cuente las células.
   6. En esta etapa, congele los progenitores de las neuronas motoras en un medio de congelación celular (consulte la Tabla de materiales), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   7. Granular las células y resuspenderlas en medio neuronal (medio Neurobasal/B27 suplementado con 20 ng/mL de BDNF, 10 ng/mL de GDNF y 200 ng/mL de ácido L-ascórbico, ver Tabla de Materiales) suplementado con 10 μM de inhibidor de ROCK.
   8. Siembre las células en poli-ornitina/laminina o, alternativamente, en soportes recubiertos de matriz a una densidad de 100.000 células/^cm2. Utilice soportes de plástico μ-Slide con cubreobjetos de polímero (consulte la tabla de materiales) para el análisis de inmunotinción.
5. El día 6, cambie el medio a Neuronal Medium fresco desprovisto de inhibidor de ROCK. En los días siguientes, refresque la mitad del medio cada 3 días. El medio de cultivo debe cambiarse con mucho cuidado para evitar que se desprenda de la superficie.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Reactivo de disociación celular
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	Suplemento sin suero para el mantenimiento de las células neuronales
Bambanker	Genética Nippon	NGE-BB02	Medio de congelación celular, utilizado aquí para los progenitores de las neuronas motoras
BDNF	PreproTech	450-02	Factor neurotrófico derivado del cerebro
Blasticidina	Sigma-Aldrich	203350	Antibiótico nucleósido que inhibe la síntesis de proteínas en procariotas y eucariotas
Bsa	Sigma-Aldrich	A2153	Albúmina sérica bovina. Agente bloqueante para evitar la unión inespecífica de anticuerpos en ensayos de inmunotinción
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	Productos químicos para soluciones electrofisiológicas
Matriz con calificación hESC de Corning Matrigel	Corning	354277	Productos químicos para soluciones electrofisiológicas
MEDIOS DE CONGELACIÓN CRYOSTEM ACF	Industrias Biológicas	05-710-1E	Medio de congelación para iPSCs humanas
D-Glucosa	Sigma-Aldrich	G5146	Productos químicos para soluciones electrofisiológicas
DAPT	AdipoGen	AG-CR1-0016-M005	Inhibidor de la gamma secretasa
Dispasa	Gibco	17105-041	Reactivo para la disociación suave de iPSCs humanas
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Medio basal para cultivo celular
doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Se utiliza para inducir la expresión de transgenes de los vectores epB-Bsd-TT-NIL y epB-Bsd-TT-NIP
DS2U	WiCell (Célula Inalámbrica	UWWC1-DS2U	Línea comercial de iPSC para humanos
GDNF (en	PreproTech	450-10	Factor neurotrófico derivado de la glía
Línea gibco episomal hiPSC	Thermo Fisher Scientific	A18945	Línea comercial de iPSC para humanos
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050038	Una alternativa a la L-glutamina con mayor estabilidad. Mejora la salud celular.
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	Productos químicos para soluciones electrofisiológicas
Ácido L-ascórbico	Laboratorios LKT	A7210	Se utiliza en cultivos celulares como antioxidante
Laminina	Sigma-Aldrich	11243217001	Promueve la unión y el crecimiento de las células neuronales in vitro
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Aminoácidos no esenciales. Se utiliza como suplemento para el medio de cultivo celular, para aumentar el crecimiento y la viabilidad celular.
Kit Neon 100 μL	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Kit de electroporación de celdas
Sistema de transfección de neón	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Sistema de electroporación de celdas
Medio Neurobasal	Thermo Fisher Scientific	21103049	Medio basal diseñado para el mantenimiento y la maduración a largo plazo de las poblaciones de células neuronales sin necesidad de una capa alimentadora de astrocitos
NutriStem-XF/FF	Industrias Biológicas	05-100-1A	Medio de cultivo de iPSC humano
Pbs	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	Tampón de fosfato de Dulbecco Solución salina, con calcio, con magnesio
Libre de PBS Ca2+/Mg2+	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Tampón de fosfato salino de Dulbecco, sin calcio, sin magnesio
Penicilina/Estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Solución de penicilina/estreptomicina utilizada para prevenir la contaminación de los cultivos celulares por bacterias.
poli-ornitina	Sigma-Aldrich	P4957	Promueve la unión y el crecimiento de las células neuronales in vitro
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5MG	Inhibidor selectivo del receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR-2)
Tritón X-100	Sigma-Aldrich	T8787	4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilenglicol, t-otilfenoxipolietoxietanol, éter de polietilenglicol terc-octilfenilo. Se utiliza para la permeabilización celular en ensayos de inmunotinción
Y-27632 (inhibidor de ROCK)	Enzo Ciencias de la Vida	ALX-270-333-M005	Inhibidor selectivo permeable a las células de la proteína quinasa (ROCK) que contiene bobina en espiral asociada a Rho. Aumenta la supervivencia de la iPSC
μ-Slide 8 pozos	Ibidi	80826	Soporte para análisis microscópicos de alta gama de células fijas