Generación de un modelo de cocultivo 3D de fibroblastos y neuronas corneales humanas

Resumen

Fuente: Sharif, R., et al. Ingeniería de tejidos corneales: un modelo in vitro de las interacciones estromal-nerviosas de la córnea humana. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra una técnica para generar un sistema modelo de cocultivo tridimensional de fibroblastos corneales humanos primarios y células neuronales diferenciadas. Este sistema de cocultivo se puede utilizar para estudiar las interacciones entre el estroma y el nervio.

Protocolo

>1. Cultivo primario de HCFs (fibroblastos corneales humanos) y ensamblaje de construcciones 3D

1. Para ensamblar construcciones 3D a partir de explantes previamente cultivados en EMEM 10% FBS 1% Antibiótico/Antimicótico, paso y recuento de HCF.
2. Siembre aproximadamente 1 x 10⁶ células/pocillo de HCF primarios en insertos de membrana de policarbonato con poros de 0,4 μm de las construcciones 3D, junto con 1,5 mL de EMEM fresco 10% FBS 1% Antibiótico/Antimicótico hasta la parte superior de la construcción. Agregue otro 1.5 mL del mismo medio a la parte inferior de cada construcción.
3. Después de 24 h de siembra celular, cultive las células con EMEM 10% FBS 1% Antibiótico/Antimicótico, estimulado con 0,5 mM de ácido 2-O-α-D-glucopiranosil-L-ascórbico (Vitamina C) añadiendo 1,5 mL en la parte superior y 1,5 mL en la parte inferior de cada construcción.
4. Mantener los cultivos en una incubadora a 37 °C, 5 % de CO₂ durante 3 semanas y suministrar medios frescos cada dos días durante todo el período de estudio. No se necesita ningún otro paso.

>2. Diferenciación celular y cocultivos

1. Después de 3 semanas, agregue 8 x 10³ células/pocillo de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y en la parte superior de las construcciones 3D previamente ensambladas que contengan 1,5 mL de EMEM que contenga 10% de FBS, 1% de antibiótico/antimicótico y 0,5 mM de ácido 2-O-α-D-glucopiranosil-L-ascórbico (vitamina C).
   1. Permitir que las células del neuroblastoma SH-SY5Y crezcan sobre las células del estroma de la córnea durante al menos 24 horas antes de iniciar la diferenciación celular.
2. Inicie la diferenciación celular SH-SY5Y estimulando las células con EMEM que contiene 1% de FBS y 1,5 mL de 10 μM de ácido retinoico en la parte superior de la construcción. Añada 1,5 mL de EMEM 10% FBS 1% Antibiótico/Antimicótico 0,5 mM 2-O-α-D-glucopiranosil-L-ascórbico (Vitamina C) a la parte inferior del constructo. Tenga en cuenta que el paso del ácido retinoico debe realizarse en la oscuridad.
   1. Continúe cultivando las células en este medio de diferenciación durante 5 días.
3. Cuando las células alcancen la fase de diferenciación, cambie las células a 1,5 mL de medio libre de suero que contenga 2 nM de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y 1% de antibiótico/antimicótico agregado al EMEM, agregando a la parte superior de la construcción. Añada 1,5 mL de EMEM 10% FBS 1% Antibiótico/Antimicótico 0,5 mM 2-O-α-D-glucopiranosil-L-ascórbico (Vitamina C) a la parte inferior del constructo. Tenga en cuenta que el paso BDNF debe realizarse en la oscuridad.
4. Cultive las células durante 2 días adicionales antes de procesarlas para cualquier análisis adicional.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución tamponada de fosfato de Dulbecco (1X)	Gibco por Life Technologies	14190-144
Pinzas estériles	Fischer Científico	Teléfono 13-812-42	Pinzas de disección de astillas de punta extrafina de Fisherbrand
Hojas de afeitar de un solo filo	Personna	270100
Hojas de bisturí quirúrgico estériles n.º 10	Cuchilla quirúrgica de plumas	2976#10
Medio Esencial Mínimo de Eagle	ATCC	30-2003
Suero Fetal Bovino	Biológicos de Atlanta	S11550	Se requiere un 10% de FBS para la preparación de los medios
Antibiótico-Antimicótico (100X)	Gibco por Life Technologies	15240-062	Se requiere un 1% de antibiótico-antimicótico para la preparación de los medios
0.05% Tripsina EDTA (1X)	Gibco por Life Technologies	25300062
Inserciones de membrana de policarbonato con poros de 0,4 μm	Coprotagonista de Corning	3412
Ácido 2-O-α-Dglucopiranosil-L-ascórbico (Vitamina C)	Sigma-Aldrich	SMB00390-14	Se debe utilizar una concentración de 0,5 mM para el estudio
SH-SY5Y Células de neuroblastoma	ATCC	SHSY5YATCC CRL-2266
Ácido retinoico	Sigma-Aldrich	SRP3014-10UG	Es necesario utilizar una concentración final de 10uM
BDNF	Sigma-Aldrich	R2625-100MG	Es necesario utilizar una concentración final de 2 nM
Dimetilsulfóxido (DMSO)	VWR-Alfa Aesar	67-68-5	DMSO estéril de grado ultra puro para ser utilizado
Thermo Scientific Nunc EasYFlask tratados con cultivo celular (T25)	Fisher Científico	12-565-351
Thermo Scientific Nunc EasYFlask tratados con cultivo celular (T75)	Fisher Científico	Teléfono 12-565-349