Inmunotinción tisular para la citometría de masas por imágenes

Resumen

El vídeo describe la preparación de una muestra de tejido para la obtención de imágenes por citometría de masas. El tejido se procesa primero para desenmascarar los epítopos del antígeno, permeabilizar las células y bloquear los sitios de unión de anticuerpos no específicos. Luego, el tejido se incuba con un cóctel de anticuerpos conjugados con metal y una tinción nuclear. Finalmente, se obtienen imágenes de la muestra de tejido tratada mediante un escáner óptico.

Protocolo

1. Pretratamiento de tejidos:

Para pañuelos frescos congelados:

1. Coloque un frasco de vidrio Coplin en el congelador a -20 ° C durante al menos una hora antes de usar.
2. Retire los portaobjetos del congelador a -80 °C y colóquelos en el frasco de vidrio Coplin en el congelador a -20 °C durante al menos 15 minutos.
3. Debajo de la campana extractora, use un cortador de ampollas para abrir la ampolla de vidrio con paraformaldehído (PFA) al 16%. Deseche los vidrios rotos de manera adecuada.
4. Agregue 10 mL de PFA al 16% y 30 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a un frasco de plástico Coplin. Asegúrese de que el PBS esté preenfriado a 4 °C.
5. Transfiera esta solución a la nevera a 4 °C durante al menos 15 minutos.
6. Después de 15 minutos, transfiera el frasco de vidrio Coplin con las correderas a la nevera a 4 ° C durante 10 minutos.
7. Transfiera los portaobjetos del frasco de vidrio al frasco de plástico Coplin que contiene la solución fría de PFA al 4%.
8. Fije los portaobjetos con PFA al 4% durante 30 minutos dentro de la nevera.
9. Enjuague los portaobjetos tres veces en PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos cada uno, asegurando un enjuague completo entre ciclos.

Para tejidos FFPE:

1. Comience con las secciones de tejido de 5 μm fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE) montadas en los portaobjetos de microscopio estándar cargados positivamente.
2. Desparafina los portaobjetos calentándolos a 60 °C durante una hora.
3. Retire los portaobjetos y enfríelos a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos.
4. Coloque los portaobjetos en un sobre de portaobjetos y enjuáguelos en un baño de xileno durante 3 minutos, dos veces.
5. Nuevamente, enjuague los portaobjetos con etanol al 100% durante 1 minuto, dos veces.
6. Del mismo modo, enjuague los portaobjetos con etanol al 95% y al 70% durante 1 minuto cada uno.
7. Por último, enjuague dos veces en agua destilada durante 3 minutos.
   nota: El Hyperion no puede ablacionarse a menos de 2 mm del borde de la corredera, centre el tejido tanto como sea posible.

>2. Recuperación de epítopos inducida por calor (HIER)

1. Prepare el tampón pH9 de ácido trisetilendiaminotetraacético (EDTA):
   1. Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER Buffer se compra a 100x y se diluye a 1x en agua de cromatografía líquida (HPLC) de alta resolución.
   2. Ej: 2,5 mL Abcam ab93684 en 247,5 mL de agua HPLC.
      nota: No se deben utilizar tampones de más de seis meses.
2. Instala una cámara de desobstrucción para calentar los portaobjetos. Primero, llene el fondo de la cámara con 500 ml de agua del grifo. A continuación, añade 250 ml de agua del grifo a ambos recipientes laterales y 200 ml de agua del grifo al recipiente central.
3. Coloque hasta 3 diapositivas en un sobre de 5 plazas.
4. Llene el sobre de portaobjetos con el tampón HIER hasta que el tejido esté completamente sumergido. nota: Asegúrese de que el sobre deslizante tenga un pequeño orificio en la parte superior para ventilar el vapor y evitar la presurización.
5. Ejecute el "Programa 4" durante 20 minutos a 95 °C.
6. Mientras tanto, precaliente las cámaras de incubación para los pasos siguientes (consulte el paso 3.5)
7. Después de la incubación, retire el sobre y colóquelo en una tina con agua fría del grifo.
8. Deja que se enfríe durante 5 minutos.
9. Retire la mitad del tampón del sobre y reemplácelo con agua destilada. Deja que se enfríe durante 5 minutos.
10. Retire gradualmente el tampón y aumente el volumen de agua dos veces, cada una con un período de enfriamiento de 5 minutos.
11. Por último, enjuague los portaobjetos con agua 100% destilada.

>3. Bloqueo del enlace no específico

1. Prepare el tampón de bloqueo (solución salina tamponada con Tris o TBS, 0,1 % de Triton X-100, 3 % de albúmina sérica bovina o BSA) añadiendo 150 uL de TBS con 10 % de BSA a 350 uL de TBS con 0,1 % de Triton X-10.
   nota: El TBS con un 10% de BSA se almacena a -20 °C y debe descongelarse fresco cada vez.
2. Usando un sobre de portaobjetos o frascos Coplin, lave los portaobjetos durante 5 minutos en TBS, 0.1% Triton X-100 dos veces.
3. Retire la diapositiva del sobre y use una toallita Kim para eliminar cualquier búfer fuera del círculo PAP. Deje que ~ 1 minuto se seque un poco.
4. Con un P200, agregue unas gotas del tampón de bloqueo sobre el pañuelo, lo suficiente para cubrirlo. La línea PAP debe mantener el líquido sobre el tejido.
   nota: Si el tampón no está confinado en el círculo de PAP, vuelva a dibujar el círculo de PAP alrededor del tejido para evitar la pérdida de anticuerpos más adelante.
5. Incubar el portaobjetos a temperatura ambiente en una cámara de humedad durante 1 hora.
   nota: Una caja de puntas de pipeta vacía funciona bien para una cámara de humedad. Asegúrese de que haya una pequeña cantidad de agua del grifo en el fondo.

>4. Tinción con anticuerpos conjugados con metales

1. Retire los anticuerpos conjugados con metales de 4 °C y centrifuga a 10.000 x G durante 1 minuto.
2. Preparación de la dilución óptima de la mezcla maestra de anticuerpos en la mezcla TBS, Triton X-100 al 0,1% y BSA al 1%
   NOTA: a) La dilución óptima de cada anticuerpo debe determinarse experimentalmente y es uno de los pasos más críticos para el éxito de los experimentos de citometría de masas por imágenes. Utilice una hoja de cálculo de Excel para calcular los volúmenes. Produzca solo un poco más de lo requerido debido al costo de los anticuerpos. Por ejemplo, si se necesitaron 200 uL de tampón de bloqueo, haga una mezcla maestra de 250 uL. b) La mezcla maestra debe prepararse fresca para cada experimento durante la etapa de bloqueo.
3. Después de la incubación (consulte el paso 3.5), retire el portaobjetos de la incubadora.
4. Elimine el exceso de tampón de bloqueo golpeando el portaobjetos vertical y horizontalmente sobre las toallitas Kim. Esto debería dejar algo de tampón de bloqueo en el tejido, pero eliminará la mayor parte.
5. Deje que ~ 1 minuto se seque un poco.
6. Coloque el portaobjetos en la cámara de humedad a 4 °C y deje que se equilibre.
7. A continuación, pipetee con cuidado la mezcla maestra de anticuerpos sobre el tejido, con mucho cuidado de que la solución esté contenida dentro del círculo de PAP.
8. Cierre la cámara de humedad e incube durante la noche a 4 °C.
9. Después de la incubación durante la noche, retire el portaobjetos a 4 °C y elimine el exceso de mezcla maestra golpeando el portaobjetos vertical y horizontalmente sobre las toallitas Kim.
10. Coloque el portaobjetos en el sobre o en el frasco de Coplin; lávese durante 5 minutos con solución salina tamponada con fosfato o PBS, complementado con Triton X-100 al 0,2%, dos veces.
11. Luego, lave el portaobjetos en PBS durante 5 minutos, dos veces. Retire el portaobjetos y deje que se seque durante aproximadamente 1 minuto.

>5. Intercalación de ADN

1. Para la intercalación de ADN, diluir el Intercalator-Ir 1:1000 en PBS.
2. Pipetear cuidadosamente el intercalador diluido sobre el tejido, teniendo mucho cuidado de que la solución esté contenida dentro del círculo de PAP.
3. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en la cámara de humedad utilizada para el bloqueo.
4. Después de eso, golpee las toallitas vertical y horizontalmente en las toallitas Kim para eliminar el exceso de tinte Intercalator-Ir.
5. Coloque el portaobjetos en el sobre o en el frasco de Coplin y lávese dos veces con agua HPLC durante 5 minutos cada uno.
6. Seque los portaobjetos en un desecador durante 5 minutos antes de escanear.

6. Escaneo de imágenes

1. Para el escaneo de diapositivas, use un grabador de vidrio con punta de carburo para rayar cuatro X tenues en la diapositiva. Los puntos de enseñanza precisos permitirán el mejor registro de imágenes.
   nota: No te acerques demasiado al borde.
2. Escanee con un escáner de documentos plano a no menos de 1200 puntos por pulgada
3. Recorta esta imagen lo más cerca posible de los bordes de la diapositiva y guárdala en una unidad flash.
4. Para el registro conjunto de imágenes, escanee la diapositiva en un Hamamatsu NanoZoomer con "Pre_IMC" en el nombre del archivo.

Resultados

Figura 1: Representación esquemática del procedimiento de inmunotinción tisular para la citometría de masas por imágenes

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Equipos
Tarros Coplin
Sobre de plástico de 5 correderas con orificio de ventilación
Dispositivo de recuperación de antígenos (cámara de desenmascarado)
escáner
Productos químicos y enzimas:
xileno
Etanol de 200 grados
Agua HPLC
Abcam ab93684 Tampón Tris-EDTA pH9 HIER
Tbs
TBS con 0.1% Trition X-100
TBS con 10% de BSA
Pbs
PBS con 0.2% Trition X-100