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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de la rebanada
- Construir u obtener una cámara de recuperación de rebanadas.
NOTA: El principio de una cámara de recuperación es sencillo y se puede hacer en el laboratorio (Figura 1). En resumen, la cámara es un receptáculo en el que se inserta una cesta para sostener los trozos de cerebro a un nivel más bajo que la superficie del líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF).
- A modo de ejemplo, obtenga cuatro anillos (de 4 a 6 mm de altura) (Figura 1A, vista lateral; B, vista superior) cortando una jeringa de 30 cc. Luego, pegue las redes estiradas (por ejemplo, cortadas de una manguera de nylon) a un lado de los anillos para sostener las rodajas de cerebro (Figura 1B) y pegue los anillos juntos.
NOTA: Se puede utilizar una pistola de pegamento.
- Una vez que los cuatro anillos estén pegados, pegue una pared de plástico isósceles curvada en forma de trapecio a dos de los anillos (Figura 1A y B) para desviar las burbujas de oxígeno de los cortes de cerebro en recuperación (Figura 1C y D). Como se muestra en la Figura 1D, inserte un sistema de difusión de oxígeno (en este caso, un tubo de dispersión de gas) en el mismo lado que las paredes de plástico.
- Antes de cortar, oxigenar (95% Ø2/5% CO2) y enfriar la solución de corte (ver paso 1.4) a 0 - 2 °C.
- Llene la cámara de recuperación personalizada con aCSF estándar a temperatura ambiente (RT). Asegúrese de que el aCSF esté bien oxigenado (20 - 30 min, el tiempo puede variar según el volumen de la cámara) antes de colocar las lonchas en la cámara de recuperación. Asegúrese de que las burbujas de gas no entren en contacto directo con las rodajas ni las interrumpan.
- Cubra la bandeja de hielo vibratome con hielo y llénela con agua fría de modo que entre un tercio y la mitad de la cámara de corte quede sumergida. Coloque con cuidado un sistema de suministro de oxígeno (por ejemplo, una piedra difusora de gas) y una sonda de temperatura en la cámara de corte para que ninguno de los elementos interfiera con el movimiento de la cuchilla o la manipulación de la rebanada.
- Prepare el área de disección y las herramientas necesarias para extraer el cerebro y diseccionar la región cerebral deseada.
NOTA: La disección exacta realizada dependerá de la región específica del cerebro estudiada, ya que las diferentes estructuras del cerebro requerirán cortes en diferentes planos (por ejemplo, cortes coronales, sagitales u horizontales).
- Coloque las siguientes herramientas en una almohadilla: tijeras de decapitación, bisturí, tijeras pequeñas de punta recta y afilada, pinzas de canulación de vasos (o cualquier herramienta quirúrgica con una punta ancha, como rongeurs, que es más adecuada para cráneos de ratas), pinzas hemostáticas curvas, pinzas, espátula, espátula de cuchara, papel de filtro, placa de Petri, hoja de afeitar de un solo filo y pegamento de cianoacrilato.
- Cuando la temperatura alcance los 0-2 °C, transfiera la solución de corte a la cámara de corte (bandeja tampón).
- Anestesiar al ratón en una cámara de desecación con isoflurano. La cantidad exacta puede variar según el tamaño de la cámara utilizada, pero para una jaula pequeña de caja de zapatos, use unas gotas (~ 3-4). Deje al ratón en la jaula hasta que quede inmóvil (sin responder a los estímulos táctiles; alrededor de 15 segundos para las condiciones descritas aquí). Realizar pruebas de pellizco de la cola y las patas para asegurarse de que el animal esté profundamente anestesiado, luego decapitar antes de que el corazón deje de latir (mejora la viabilidad celular).
NOTA: Con la debida justificación, algunos laboratorios obtienen la autorización para realizar decapitaciones en vivo con el fin de minimizar al máximo los procesos excitotóxicos y mejorar la viabilidad celular.
- Realice la disección.
NOTA: El cerebro debe extraerse rápidamente (<45 seg).
- Con el bisturí, corte la piel superficial de la parte superior del cráneo desde la rostral hasta la caudal.
- Pela el cuero cabelludo a cada lado de la cabeza.
- Con unas tijeras pequeñas, rectas y afiladas, corte la placa interparietal a lo largo de la sutura lambdoidea para eliminar el cerebelo. Extirpa el hueso occipital.
- Con las mismas tijeras, corta la sutura sagital.
- Deslice las pinzas de canulación de los vasos sanguíneos (o rongeurs si se rompe el cráneo de una rata) por debajo de cada hueso parietal y tire para exponer el cerebro.
- Con las pinzas hemostáticas curvas, pellizque los huesos frontales para romperlos, luego use pinzas o pinzas de canulación de vasos para extraer los huesos rotos. Corta y retira la duramadre lo más suavemente posible, ya que puede interferir con la disección.
- Deslice la espátula por debajo del cerebro y sáquela suavemente del cráneo. Colóquelo en la cámara de corte (bandeja tampón) previamente llenada con aCSF helado. Deje que el cerebro se enfríe durante 1-2 minutos.
- Prepare la plataforma de disección llenando una placa de Petri con hielo y un poco de agua helada para permitir un mayor contacto con la superficie. Cubre el plato con su tapa y coloca papel de filtro encima. Humedece el papel de filtro con aCSF frío.
- Una vez que el cerebro se enfríe, coloque el cerebro en la placa de Petri llena de hielo y realice rápidamente la disección adecuada para obtener el plano de corte deseado.
- Para obtener cortes sagitales que contengan el núcleo accumbens (NAc), use una hoja de afeitar de un solo filo para cortar y eliminar los tubérculos olfativos y el cerebelo si aún están presentes. A continuación, realice un corte sagital de 2-3 mm desde el borde lateral del hemisferio derecho para obtener la superficie plana que se pegará en la placa de sujeción de la muestra (véase el paso 1.8.11).
NOTA: Cortar solo 2 - 3 mm del borde lateral del hemisferio permitirá la recolección de rodajas que contengan el NAc de ambos hemisferios. La disección adecuada dependerá de la región del cerebro que se investigue. Aquí, la disección se realiza para que las neuronas NAc puedan registrarse en cortes de cerebro sagital.
- Pegue rápidamente (usando pegamento de cianoacrilato aplicado a la placa de sujeción de la muestra) la superficie de corte plana del cerebro en la placa de acuerdo con el plano de corte deseado. Para obtener cortes de cerebro sagital, consulte el paso 1.8.10.
- Coloque y asegure inmediatamente la placa de sujeción de la muestra en la cámara de corte para que el cerebro se corte cara-caudalmente (por seguridad, coloque el soporte de la cuchilla solo cuando la placa de la muestra esté asegurada).
- Ajuste el vibratomo con los parámetros de corte apropiados (parámetros utilizados en el laboratorio para el vibratomo mencionado en Materiales: velocidad 3 - 4, vibración 9-10 y espesor de corte 250 μm).
- Después de cortar, use una pipeta de transferencia con borde de plástico para transferir los cortes de cerebro a la cámara de recuperación (en RT) (consulte el paso 1.3). El tiempo de recuperación puede variar dependiendo del tipo neuronal que se esté estudiando (normalmente de 30 a 90 min).
>2. Grabación de micropipetas y preparación de equipos
- Consulte las directrices específicas del manual del usuario del extractor para obtener las propiedades deseadas de la micropipeta.
NOTA: Para los MSN, utilizamos un rango de resistencia de pipeta de 3,2-4,0 MΩ.
- Oxigenar el aCSF y ajustar el caudal a 2 ml/min. Aspirar el aCSF mediante una bomba peristáltica o líneas de vacío instaladas en la instalación.
- Encienda el controlador del calentador de perfusión y ajuste la temperatura para obtener la temperatura deseada (por ejemplo, 31,8-32,2 °C).
NOTA: La estabilidad de la temperatura depende de tener un nivel constante de aCSF y una velocidad de flujo constante en la cámara. Dado que varias propiedades biofísicas de las neuronas (por ejemplo, la resistencia de entrada, Ri, también llamada resistencia de membrana, Rm) son sensibles a la temperatura, es importante mantener una temperatura estable.
- Encienda el amplificador controlado por computadora, la cámara, el micromanipulador y la luz de fondo del microscopio. Si realiza un experimento que requiere estimulación eléctrica del tejido, encienda el controlador de estímulo y la unidad de aislamiento.
NOTA: Algunos amplificadores de otros fabricantes recomiendan un "calentamiento" antes de su uso, por lo que se recomienda consultar el manual para conocer el procedimiento de funcionamiento exacto.
- Inicie la captura de la cámara, la adquisición de señal y el software del amplificador.
- Colocación y visualización de cortes:
- Con una pipeta de transferencia de plástico con punta recortada, extraiga suavemente un trozo de cerebro de la cámara de recuperación.
- Coloque la pipeta de transferencia en la cámara de registro y exprima suavemente la rebanada de la pipeta sobre el cubreobjetos que recubre la parte inferior de la cámara.
NOTA: Siempre y cuando no se produzca un desbordamiento, es inofensivo que algo de aCSF de la cámara de recuperación se derrame en el baño.
- Utilice fórceps para alterar la posición de la rebanada, de modo que el área deseada se coloque exactamente en el centro de la cámara de registro. Utilice la lente del objetivo de baja potencia (4X) del microscopio y el ocular para obtener ayuda en el posicionamiento.
- Una vez que se haya alcanzado la posición deseada, asegure la posición del corte de cerebro con un sujetador de corte (también conocido como "arpa") en la cámara.
- Cambie a una lente de objetivo de alta potencia (40X) y bájela suavemente hasta que se forme contacto con el aCSF en la cámara.
- Utilice la rueda de ajuste fino para enfocar el tejido. Mientras esté en contacto con el aCSF, no utilice la rueda de ajuste gruesa del microscopio, ya que bajar excesivamente la lente del objetivo puede aplastar el corte o incluso romper el cubreobjetos que recubre la parte inferior de la cámara, lo que puede hacer que el aCSF se derrame sobre el condensador y lo dañe.
- Cuando el enfoque está a nivel de tejido, observe las células en la región objetivo para ver la forma. Las células muertas son fácilmente identificables por su membrana plasmática y núcleo hinchados (Figura 1E). Las células sanas deben aparecer como estructuras homogéneas redondas, ovoides o elípticas (Figura 1E).
- Busque una celda objetivo. Márquelo en la pantalla del ordenador para ayudar a guiar la micropipeta de grabación. Si utiliza software como QCapture, dibuje un cuadrado alrededor de la celda de destino manteniendo pulsado el clic izquierdo del ratón.
- Eleve la lente del objetivo de modo que haya suficiente espacio en el cono formado por la lente del objetivo que está en contacto con el aCSF para colocar y mover la micropipeta de grabación.
- Colocación y posicionamiento de micropipetas
- Utilizando una jeringa de 1 ml, una aguja de microjeringa no metálica y un filtro específico, llene una micropipeta con la solución interna preparada de antemano según el experimento planificado (solución interna basada en K+ o Cs+, consulte Materiales para la composición). Utilice suficiente solución para que la solución interna entre en contacto con el electrodo de alambre de plata recubierto de cloruro dentro del soporte de la micropipeta.
NOTA: El electrodo de alambre de plata se puede clorar sumergiéndolo en lejía doméstica. Los trifosfatos de nucleósidos (trifosfato de adenosina, ATP y trifosfato de guanosina, GTP) se pueden agregar a la solución interna antes de su uso. Mantenga la jeringa que contiene la solución en hielo para evitar la degradación de ATP/GTP.
- Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la micropipeta, ya que pueden salir mientras la micropipeta está en el pañuelo y oscurecer la rebanada.
- Coloque la micropipeta en el portaelectrodos de modo que la solución entre en contacto con el electrodo de alambre recubierto de cloruro de plata.
- Apriete la tapa de la pipeta para que la arandela cónica forme un sello alrededor de la micropipeta.
- Aplique presión positiva antes de sumergir la micropipeta en el aCSF para evitar que entren residuos en la pipeta.
- Coloque la etapa principal en la posición bloqueada (frente a la cámara) y, con el micromanipulador, guíela hacia la cámara para que quede aproximadamente debajo del centro del objetivo sumergido.
- Mientras mueve la micropipeta con el micromanipulador (ajustado a velocidad media a alta), utilice la pantalla del ordenador para localizar la micropipeta y guiarla hacia la ubicación de la célula en el eje X-Y.
- Mida la resistencia de la micropipeta aplicando un paso de voltaje (por ejemplo, 4 mV durante 100 ms), que se puede lograr de forma manual o automática a través de un software específico, como el modo "baño" si se utiliza "Prueba de membrana" en el software Clampex (consulte también el paso 4). Para asegurarse de que no haya burbujas de aire ni ningún otro objeto extraño que bloquee la micropipeta, aplique presión positiva con la jeringa llena de aire (por ejemplo, jeringa de 30 cc) conectada al soporte de la micropipeta con tubo de polietileno.
- Después de limpiar la micropipeta, realice una compensación de voltaje para reducir la corriente de la pipeta a cero, lo que se puede lograr manualmente o a través de un software específico como 'compensación de pipeta' en el amplificador controlado por computadora commander.
NOTA: Esta función compensará cualquier voltaje causado por las diferencias de concentración entre el baño y las soluciones de micropipeta (es decir, el potencial de unión líquida).
>3. Prueba de membrana
NOTA: Este paso se aplica al amplificador mencionado en los Materiales.
- Cuando utilice un controlador de amplificador controlado por computadora, siempre configúrelo en modo de pinza de voltaje para realizar la prueba de membrana.
NOTA: Cuando la prueba de membrana está configurada en el modo "Baño", la prueba de membrana permite la medición de la resistencia de la micropipeta y la resistencia del sellado cuando se forma el sello.
- Una vez que se rompe la membrana (ver paso 4.8), cambie la prueba de membrana al modo "Celda" para que se pueda obtener la resistencia en serie (Rs) (también llamada resistencia de acceso, Ra), Ri y la capacitancia de la membrana (Cp).
>4. Aproximación final, formación de sellos y obtención de la configuración de la célula completa
- Con la rueda de enfoque fino, comience a enfocar hacia abajo mientras baja la micropipeta gradualmente. Enfoque siempre primero hacia abajo y luego baje la micropipeta hasta el plano de enfoque. Esto asegurará que la punta de la micropipeta no penetre bruscamente en la rebanada.
- Cuando la micropipeta entre en contacto con la superficie de la rebanada, reduzca la velocidad del micromanipulador hasta el modo medio-bajo.
- Aplique suavemente una ligera presión positiva con la jeringa llena de aire conectada al soporte de pipeta para eliminar cualquier residuo de la ruta de aproximación.
- Acérquese a la celda alternando con las perillas de control X-Y-Z, o acercándose en diagonal (si el modelo de micromanipulador lo permite) donde ambos ejes X-Z se cambian con la rotación de la perilla del eje Z. Este último método evitará la compresión vertical del tejido.
NOTA: Aquí, el objetivo es acercarse a la célula infligiendo un daño mínimo a la rebanada. Cuando la micropipeta está lo suficientemente cerca de la célula, aparece un hoyuelo (una decoloración redonda de la superficie de la célula causada por la presión positiva aplicada a través de la punta de la micropipeta) (Figura 2).
- Cuando aparezca el hoyuelo (Figura 2-1), aplique una succión débil y breve a través del tubo que está conectado al tubo de succión del soporte de la pipeta para crear el sello (Figura 2-2). Siga monitoreando la prueba de membrana.
NOTA: Si se forma un sello parcial (<1 GΩ), inyectar corrientes negativas disminuyendo el potencial de retención (en el comandante del amplificador controlado por computadora) puede facilitar la formación de sellos y alcanzar una resistencia de gigaohmios ("sello de gigaohmios" o "gigasello" >1 - 5 GΩ). La alta resistencia del sello (>1 GΩ) limitará la contaminación acústica de la señal registrada y contribuirá a la estabilidad mecánica del parche.
- Mientras se forma un gigasello, utilice el comandante del amplificador controlado por ordenador para acercar el potencial de retención de la célula lo más posible al potencial de reposo fisiológico (reposo en V) con el fin de evitar cambios bruscos una vez que se rompe la membrana. Por ejemplo, los MSN suelen estar fijados por tensión a -70 o -80 mV (reposo V fisiológico: -70 a -90 mV).
- Una vez que se haya formado el gigaseal, compense la capacitancia rápida y lenta de forma manual o automática. Si utiliza un controlador de amplificador controlado por computadora, como el controlador Multiclamp, presione 'Auto' para 'Cp Rápido' y 'Cp Lento'.
- Si el sello permanece estable y por encima de 1 GΩ (o inyectando menos de 10 - 20 pA para mantener la célula en el potencial de membrana deseado), aplique una succión breve y fuerte a través del mismo tubo que en 4.5 para romper la membrana plasmática (Figura 2-3).
NOTA: Esto puede llevar varios intentos. Una buena ruptura de la membrana se logra cuando la succión se realiza con la suficiente fuerza para que la membrana rota no obstruya la micropipeta (lo que puede conducir a un aumento de Rs durante el registro), pero lo suficientemente débil como para no arrastrar una gran parte de la membrana o la célula.
- Después de lograr una configuración exitosa de la celda completa, supervise regularmente la ubicación de la micropipeta para evaluar y corregir la deriva significativa, ya que puede provocar la pérdida del parche. La amplitud de la deriva puede variar de acuerdo con varios factores, por ejemplo, la calidad de la instalación de la plataforma y las fuerzas de tracción en la etapa principal. Idealmente, la deriva debería ser casi inexistente.
- Al cambiar al modo "Celda" en la prueba de membrana, vea diferentes parámetros de la celda, como Ri, Rs y Cp. Supervise estos parámetros durante la grabación.
NOTA: Todos estos parámetros pueden ayudar a evaluar el estado de salud inicial de las células y los tipos de células (consulte la sección "Prueba de membrana", paso 4).
