Grabaciones de patch-clamp de la dendrita de una neurona dopaminérgica en un corte de cerebro

Resumen

Fuente: Engel, D. Registros subcelulares de patch-clamp del dominio somatodendrítico de las neuronas dopaminérgicas nigrales. J. Vis. Exp. (2016).

Este video muestra una técnica para el registro de patch-clamp desde la superficie de la membrana dendrítica. Esto ayuda a examinar directamente las propiedades eléctricas de las dendritas y los canales iónicos subyacentes dependientes de voltaje en las neuronas dopaminérgicas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de las soluciones

1. Líquido cefalorraquídeo artificial estándar (ACSF; Tabla 1)
   1. Use sales de alta pureza y vasos de precipitados de vidrio limpios previamente enjuagados con agua bidestilada para preparar una solución fresca. Utilice agua bidestilada de alta calidad para la preparación de todas las soluciones extracelulares e intracelulares.
   2. De acuerdo con la Tabla 1, tome un vaso de precipitados de 2 L para disolver NaHCO₃ en 500 mL de agua y otro para disolver las otras sales para evitar la precipitación de iones divalentes. Limpie la espátula sistemáticamente con agua bidestilada y séquela antes de tomar una sal. Utilice un agitador magnético para homogeneizar la disolución. Añada las soluciones de ambos vasos de precipitados a un matraz aforado adecuado y llévelas al volumen adecuado.
   3. Asegúrese de que la solución extracelular final sea totalmente transparente y sin ningún rastro de precipitación.
   4. Aplique una mezcla de gases compuesta por un 95% de_O2 y un 5% de CO₂ (gas carbógeno) con una vela de microfiltro de vidrio (Ø 13 mm) 20 - 30 min antes de fundir las rodajas. Controle cuidadosamente la osmolaridad (2 - 3 mediciones consecutivas) del ACSF con un osmómetro (rango óptimo: 314 - 325 mOsmol/L). Almacene la solución restante después de la preparación a 4 °C y utilícela en un plazo de 3 días.
2. Solución de corte (sacarosa-ACSF; Tabla 2)
   1. Prepare 3 L de solución fresca. Use 1 L para preparar rodajas de cerebro de un animal. Guarde la solución restante a 4 °C y utilícela en un plazo de 3 días.
      NOTA: Se utilizan concentraciones altas de Mg²⁺ y bajas de Ca²⁺ para disminuir la transmisión sináptica, y parte de NaCl se sustituye por sacarosa para preservar el tejido.
3. Soluciones intracelulares
   1. Prepare con anticipación una solución de 100 mL para registros duales de células enteras (Tabla 3).
   2. Incluir metilsulfato para obtener una buena recuperación de la morfología celular. Añadir biocitina (0,1 - 0,4%) para examinar posteriormente la morfología de la neurona. Incluya un tinte fluorescente (por ejemplo, Alexa 594 o Sulforhodamine 101 41) para seguir la extensión de las dendritas durante la grabación (opcional).
   3. Prepare con anticipación 100 mL de solución de electrodos para registros conectados a la celda (Tabla 4). En este caso, la solución interna es una solución de alto K⁺ diseñada para aislar la corriente catiónica activada por hiperpolarización macroscópica (Ih) y contiene bloqueadores para los otros canales iónicos dependientes de voltaje.
   4. Almacene las soluciones intracelulares en alícuotas de 2 ml a -20 °C. Utilice una nueva alícuota para cada nueva sesión de grabación. Verifique cuidadosamente la osmolaridad de cada alícuota descongelada con un osmómetro. Tome una nueva alícuota si la osmolaridad no corresponde al valor inicial.
   5. Transfiera la solución de la alícuota a una jeringa de 3 mL, encima de la cual se coloca un filtro de jeringa estéril de 0,22 μm. Mantenga la jeringa en hielo durante la sesión de grabación para limitar la degradación de sus compuestos (ATP, GTP o fosfocreatina).

>2. Fabricación y llenado de pipeta de parche

1. Tirando
   1. Utilice un extractor de electrodos horizontal y un tubo de vidrio de borosilicato de paredes gruesas. Para grabaciones de celda completa y adjuntas a celdas, utilice un diámetro exterior de 2 mm/diámetro interior de 1 mm. Asegúrese de que el tubo de vidrio esté absolutamente limpio.
   2. Si este no es el caso, sumerja primero los capilares de vidrio en un solvente orgánico (por ejemplo, etanol) y luego en agua bidestilada. Caliente brevemente los extremos capilares con un mechero Bunsen. Alternativamente, pida tubos de vidrio lavados y calentados directamente al fabricante (consulte la lista de materiales).
   3. En el caso de los registros somatodendríticos duales, asegúrese de que la resistencia de la pipeta somática esté entre 6 y 10 MΩ y entre 8 y 19 MΩ para las pipetas dendríticas cuando se llenen con solución intracelular (Tabla 3). Estandarizar la resistencia de la pipeta para registros adheridos a células a una resistencia de 10 MΩ para lograr resultados comparables a lo largo del dominio somatodendrítico de la neurona.
   4. Prepare pipetas nuevas antes de cada sesión de grabación (todos los días) o inmediatamente antes de parchear y utilícelas de 5 a 8 h después de su fabricación. Guarde las pipetas en un recipiente de vidrio tapado para protegerlas del polvo y la obstrucción de la punta.
2. pulido
   1. Inspeccione y pula con calor cada punta de pipeta con una microforja para obtener mejores sellos con la membrana. Antes de usar la microforja, derrita un pequeño trozo de vidrio en el filamento de calentamiento de platino. Reemplace este recubrimiento de vidrio en el filamento de platino diariamente para mayor constancia (Peter Jonas, comunicación personal)
      nota: Las pipetas utilizadas para las grabaciones conectadas a la célula se pueden recubrir antes del paso de pulido térmico para reducir el ruido de fondo. Se puede utilizar un agente aislante como cera dental fundida o un elastómero de silicona para recubrir las pipetas.

>3. Preparación de rebanadas de cerebro

1. Utilice ratas Wistar sanas de entre 16 y 19 días de edad. No utilice animales enfermos o que sufran de hipotermia o deshidratación. Antes de comenzar la preparación de las lonchas, mantenga al animal en un lugar seguro y silencioso. Evite tener cualquier otro animal en la habitación mientras prepara un animal. Manipula a los animales con cuidado.
2. Vierta sacarosa-ACSF en dos vasos de polipropileno (PP) de 400 ml y colóquelos en el congelador a -80 °C durante 45 min. Mezcle la solución para obtener una solución líquida/congelada helada homogénea y coloque los vasos de precipitados en hielo. Suministre la solución de sacarosa-ACSF con gas carbógeno utilizando una vela de microfiltro (Ø 13 mm) en cada vaso de precipitados de PP.
3. Prepare la cortadora y la cámara de reserva
   1. Utilice una cortadora de pañuelos de alta calidad con vibraciones verticales extremadamente bajas para minimizar el daño a las capas superficiales de las rebanadas tanto como sea posible. Fije una hoja de afeitar nueva y completa en la cortadora.
   2. Use una hoja de afeitar nueva para cada sesión de corte. Evite doblar la hoja de afeitar. No retire la película grasa de la superficie de la hoja de afeitar (Josef Bischofberger, comunicación personal).
   3. Si está disponible, verifique la vibración vertical con una vibrosonda proporcionada por el fabricante. Alternativamente, use una vibrosonda hecha a medida. Reduzca las vibraciones verticales de la cuchilla para que esté lo más cerca posible de 0 μm.
   4. Prepare una cámara de reserva de 150 mL para rodajas. Vierta ACSF estándar en la cámara de reserva y colóquelo en un baño de agua. Suministre carbógeno a la solución de la cámara de reserva mediante una vela de microfiltro (Ø 6 mm). Asegúrese de que las burbujas de carbógeno sean lo más pequeñas posible.
      nota: Construya una nueva cámara de reserva cada 2 o 3 meses para mantener constante la calidad de la rebanada.
4. Cortar rodajas
   1. En una habitación silenciosa en la que el experimentador no esté perturbado ni estresado, decapitar al animal con unas tijeras de cirugía (longitud 150 mm) a nivel de la médula cervical.
   2. Corta la piel de la parte superior de la cabeza del animal en dirección nasal a caudal con un bisturí y retírala lateralmente. Corta la parte superior del cráneo desde la parte caudal hasta la parte nasal de la cabeza con unas tijeras finas y retira ambas partes del cráneo lateralmente. Retire el cerebro con una espátula fina y colóquelo con cuidado en un vaso de precipitados de PP que contenga sacarosa-ACSF fría como hielo (0 - 4 °C) equilibrada con carbógeno.
      nota: Esta secuencia de pasos debe realizarse lo más rápido posible, pero también de forma meticulosa (<<1 min, aproximadamente 40 s).
   3. Mantenga el cerebro en la solución del vaso de precipitados PP durante ~ 2 a 5 min. Ajuste la presión del carbógeno para evitar movimientos cerebrales. Si las burbujas de carbógeno son demasiado grandes, reemplace la vela del microfiltro por una nueva.
   4. Coloque el cerebro en una placa de Petri de 9 cm cuyo fondo interior esté cubierto con una capa de Sylgard de ~0,5 cm de grosor. Prepara esta placa de Petri con anticipación.
   5. Rodea el cerebro con sacarosa helada-ACSF. Asegúrese de que alguna fase líquida de la solución de ACSF-sacarosa sumerja el cerebro. En el caso de los cortes coronales, corte la parte frontal del cerebro en el plano coronal con un bisturí o una hoja de afeitar. Extirpa el cerebelo con una incisión coronal.
   6. Aplique pegamento de cianoacrilato en la bandeja de muestras (área ~ 1 cm²). Pega el bloque cerebral de manera que la parte frontal mire hacia la etapa de corte. Gotee con cuidado sacarosa-ACSF sobre el cerebro pegado utilizando la gran abertura de una pipeta Pasteur de vidrio y, a continuación, sumerja lentamente la cámara de corte de la cortadora. Maniobre la bandeja de muestras de modo que la superficie de corte (es decir, el primer tejido que golpee la hoja) sea la superficie ventral del cerebro.
   7. Aplique el carbógeno con una vela de microfiltro de vidrio doblado (Ø 6 mm) a la cámara de corte (opcional).
   8. Ajuste la hoja de afeitar en un ángulo de ~15° con respecto al plano horizontal. Corte cortes coronales de cerebro de ~500 μm en la dirección caudal a nasal antes de alcanzar la sustancia negra. Disminuya el grosor para cortar rodajas de 300 a 350 μm de grosor que contengan la región de interés.
   9. Separe las rebanadas del bloque de tejido con una aguja de perfusión muy delgada unida a una jeringa paralela al borde de la hoja de afeitar. Doble la aguja para que tenga un ángulo de 90° entre la aguja y la jeringa. Asegúrese de que no se aplique presión a la hoja de afeitar mientras retira el corte del bloque de tejido.
5. Almacenar rebanadas
   1. Transfiera las rodajas utilizando la abertura más grande de una pipeta Pasteur de vidrio (unida a una bombilla) a la cámara de reserva. Una vez que todas las lonchas se transfieren a la cámara de reserva (Christoph Schmidt-Hieber, comunicación personal) lleve la temperatura del baño de agua a 34 °C durante 0,5 - 1 h.
   2. Después de este período, apague el baño de agua y mantenga las rodajas a temperatura ambiente. Ajuste la presión del carbógeno para evitar movimientos de las lonchas en la cámara de reserva. Mantenga los cortes durante otros 10 a 20 minutos antes de comenzar las grabaciones.
   3. Limpie el equipo y las velas del microfiltro con cuidado pero a fondo con agua destilada doble al final del procedimiento de corte.

>4. Registros Somáticos y Somatodendricos Duales en Neuronas Nigrales y Archivo de Biocytin

1. Siga las descripciones para el montaje de una configuración de abrazadera de parche para rebanadas que se dan en la Guía de Axon.
2. Preparar la cámara de grabación
   1. Coloque 1 - 2 mL de agua bidestilada en la cámara de registro. Verifica que no tenga fugas. Coloque la cámara de registro en la mesa de desplazamiento x-y.
   2. Alimente ACSF estándar a través de un sistema de tubos de perfusión impermeables al oxígeno (politetrafluoroetileno) a la cámara de registro. Estabilizar el flujo de perfusión en la cámara a una velocidad de 4 - 5 mL ^min-1. Mantenga la longitud del tubo que une el vaso de precipitados que contiene ACSF y la cámara de registro lo más corta posible (1 m).
   3. Seleccione un trozo de cerebro de la cámara de reserva y transfiéralo a la cámara de grabación utilizando la abertura más grande de una pipeta Pasteur de vidrio. Cubre el corte con un anillo de platino para anclarlo en el fondo de la cámara de grabación. Utilice un anillo plano de platino (Ø 1,5 cm) y pegue hilos de nailon paralelos (espaciado >2 mm) sobre él.
3. Ajuste y optimice la óptica
   1. Visualice los cortes mediante microscopía de vídeo infrarroja (IR). Ajuste la iluminación Köhler 51 y optimice la óptica de contraste de interferencia diferencial (DIC) o la iluminación oblicua (contraste de gradiente Dodt - DGC).
   2. Comprueba la calidad de la rebanada. Mantenga solo rodajas con superficies lisas y uniformes que no estén demasiado contrastadas y que tengan solo cráteres pequeños y dispersos.
   3. Llene 2 pipetas de parche nuevas y sin usar con solución intracelular (Tabla 3). Utilice un tubo de 0,5 ml que contenga la solución de pipeta para llenar la punta de la pipeta por capilaridad. Para acelerar el llenado de la punta de las pipetas sin filamento, aplique presión negativa al extremo de la pipeta utilizando un tubo conectado a una jeringa.
4. Coloque las pipetas por encima de la superficie de la rebanada
   1. Verifique la presencia de recubrimiento de cloruro en los alambres de plata.
   2. Inserte las pipetas secuencialmente en los soportes de pipetas y aplique presión positiva (~70 mbar) utilizando un circuito de tubos que conecta el soporte de pipetas, un grifo de tres vías y un manómetro. Baje la pipeta en el baño de la cámara de grabación.
   3. Compruebe que el valor de la presión en el manómetro sea constante durante ~1 - 2 min. Si la presión está disminuyendo, compruebe el tubo o las juntas tóricas de sellado dentro del soporte de la pipeta.
   4. Coloque la punta de la pipeta en el centro del monitor de vídeo y asegúrese de que no esté obstruida. Asegúrese de que la punta de la pipeta no se mueva al aplicar o liberar presión sobre la pipeta.
   5. Compruebe la deriva y las vibraciones de la punta de la pipeta dibujando una pequeña cruz en el centro del monitor exactamente en la posición de la punta de la pipeta y observe durante 5 minutos los posibles movimientos de la punta.
   6. Aplique un paso de voltaje (5 mV) para monitorear la resistencia de la pipeta en un osciloscopio. Ajuste el potencial de retención del amplificador de abrazadera de parche a 0 mV. Cancele el potencial de compensación de la pipeta de modo que la corriente de la pipeta de CC lea cero en el medidor del amplificador.
   7. Mueva las pipetas hacia abajo hasta la rebanada y manténgalas por encima de la superficie.
5. Seleccionar y parchear una neurona con dendritas largas
   1. Dentro de la sustancia negra, seleccione una neurona sana con dendritas largas que se pueda seguir a larga distancia aproximadamente en el mismo plano (Figura 1A y 1B) utilizando el contraste de gradiente IR-DODT (IR-DGC). Elija un cuerpo celular liso y homogéneo. Evite las dos celdas fuertemente contrastadas en la superficie del corte (Figura 1C y 1D), ya que es difícil de romper y preservar condiciones de registro estables a lo largo del tiempo (resistencia de serie estable). Seleccione neuronas que tengan su soma de 10 a 30 μm por debajo de la superficie del corte.
   2. Mueva el electrodo somático cerca del soma (a 40 - 50 μm de distancia) y el electrodo dendrítico cerca de la dendrita a la misma distancia. Utilice un aumento de 2X (cambiador cuádruple) para seleccionar y parchear una parte de una dendrita. Obtenga en el monitor un aumento absoluto de 2.100X sin aumento (1X) y de 5.500X con un aumento de 2X.
   3. Libere ligeramente la presión de la pipeta somática en 10 mbar. Si es necesario, regule la presión de la pipeta dendrítica y somática para evitar el desplazamiento de la estructura celular (soma y dendrita) dentro del corte.
   4. Coloque la pipeta dendrítica cerca de la membrana para ver un pequeño hoyuelo. Libere la presión sobre la punta de la pipeta y parchee la dendrita mientras controla la resistencia de la pipeta. En condiciones ideales, solo una succión muy ligera es suficiente para obtener un buen sellado.
   5. Reduzca la amplitud de los transitorios de capacitancia de la pipeta tanto como sea posible en la parte superior del paso de corriente utilizando un pulso de voltaje con alta ganancia y poco filtrado 51 y el osciloscopio. Ingrese al modo de celda completa con la pipeta dendrítica.

Resultados

Tabla 1: Líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF)

...

sustancia	g/mol	concentración	para 1 L
NaCl	58.443	125 mM	7.305 g
NaHCO3	84.007	25 mM	2.100 g
Kcl	74.551	2,5 mM

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agua bidestilada	Millipore	Súper Q	Resistividad >14 MΩ cm, ideal 18,2 MΩ cm a 25 °C, filtrado (0,22 μm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Velas de microfiltro	Robu	Porosidad 3, 6 mm o 13 mm de diámetro
Cortadora de pañuelos con vibrosonda	Leica	VT1200	Parámetros de corte: velocidad 0,07, amplitud 1,40
Cortadora de pañuelos	Dosaka	DTK-1000	Parámetros de corte: velocidad 4, frecuencia 7
Afeitar	Gilette	Súper Plata
Herramientas de disección	Braun, Aesculap
Cámara de reserva			Hecho a medida
PP Beckers	VWR	213-1725	400 ml
Filtro de jeringa	Merk Millipore	Millex - GV 0,22 μm
Pegamento de cianoacrilato	UHU	"Sekunden Kleber"	pegamento líquido
Cámara de grabación	Luigs & Neumann	Mini cámara de lonchas
Extractor de pipetas horizontal	Instrumentos Sutter	Marrón-Llameante P-97
Pipetas	Hilgenberg	1807524	Capilares de vidrio de 2 mm de diámetro exterior/1 mm de diámetro interior, extremos pulidos al fuego, lavados
Cera dental	Coltène/Whaledent		Tiras de cera para bandejas de ortodoncia
Rejilla de platino			para anclar lonchas en la cámara de grabación, hecho a medida con un disco de platino
Microforja	Narishige	MF-830	para pulir al fuego las puntas de pipeta
Metil sulfato de potasio	MP Biomedicals	215481
Biocitina	Sondas moleculares	B1592
manómetro	GREISINGER electrónico	GDH 13 AN
microscopio	Zeiss	Fs
Contraste de degradado Dodt	Luigs & Neumann
Manipuladores	Luigs & Neumann	LN Mini 25
Capturador de fotogramas	La fuente de imágenes	DFG/USB2pro
cámara	DAGE-MTI	NC-70
condensador	Zeiss		Condensador de alta apertura numérica que funciona con aceite
objetivo	Zeiss	W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR	Objetivo de inmersión en agua 1.0 con aumento de 63x, larga distancia, alta apertura numérica
Cambiador cuádruple	Luigs & Neumann		entre la cámara y el microscopio
Monitor de vídeo en blanco y negro	Sony	SSM-175CE	16 pulgadas, 850 líneas de TV, analógico
Botellas de muestra, vidrio ámbar, con tapa	VWR	215-2409	para transferir cortes de la configuración a la sala de histología
La guía de Axon	Dispositivos moleculares		libro
Paraformaldehido	sigma	441244	consulte la HOJA DE DATOS DE SEGURIDAD y la Directiva de Sustancias Peligrosas (UE) antes de usar
Placa de cultivo celular de pozo	Greiner-Bio-One	662160	para la tinción de lonchas fijas
Tritón X-100	Merk	108643	consulte la HOJA DE DATOS DE SEGURIDAD y la Directiva de Sustancias Peligrosas (UE) antes de usar
ProLong Diamante Antidecoloración	Sondas moleculares - Thermo Fisher Scientific	P36961